Questo metodo ci permetterà di isolare le particelle del virus Epstein Barr dalla linea cellulare P3HR1 e quantificare lo stock virale in modo che possa essere utilizzato per vari scopi di ricerca. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo relativamente facile, economico, veloce e affidabile per preparare uno stock virale EB. Le particelle vitali prodotte da questa tecnica possono essere utilizzate in molti modelli sperimentali in vitro o in vivo per la diagnosi di EB.To iniziare, preparare un volume di sospensione cellulare A in un tubo conico da 15 millilitri, regolare il volume in modo tale che il numero di cellule sia di circa 2,2 milioni di cellule per una piastra di coltura da 100 millimetri.
Aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura completo al tubo. Aggiungere 80 microlitri di dimetilsolfossido al tubo. Quindi aggiungere 350 microlitri di un milligrammo per millilitro di PMA al tubo.
La concentrazione finale di PMA dovrebbe essere di 35 nanogrammi per millilitro e quella di DMSO dovrebbe essere dello 0,08% Aggiungi 4,27 millilitri di terreno di coltura in modo che il volume totale sia di 10 millilitri. Mescolare il contenuto del tubo inclinandolo, quindi trasferire il contenuto in una piastra di coltura da 100 millimetri. Lasciare la piastra in un incubatore di coltura cellulare per cinque giorni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.
Dopo cinque giorni nell'incubatore centrifugare il contenuto della piastra a 120 G per otto minuti per pellettare le cellule Raccogliere il virus privo di cellule contenente surnatante e scartare il pellet cellulare. Centrifugare nuovamente il surnatante a 16.000 G per 90 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare le particelle virali. Scartare il surnatante e risospendere il pellet virale in cinque millilitri di terreno di coltura, Aliquot la sospensione virale in 20 provette contenenti ciascuna 250 microlitri di sospensione virale e conservare la sospensione a meno 80 gradi Celsius.
Per separare le proteine dal DNA aggiungere 500 microlitri di fenolo Tris-saturo a uno dei tubi contenenti il preparato virale. Aggiungere 100 microlitri di acqua e vortice bene per ottenere un'emulsione rosa. Centrifugare per 15 minuti a 9.650 G, raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Aggiungere un equivalente di un decimo del volume surnatante di acetato di sodio freddo e mescolare mediante pipettaggio su e giù. Quindi aggiungere un microlitro di 20 milligrammi per millilitro di glicogeno e mescolare mediante pipettaggio. Aggiungere tre volte il volume di etanolo freddo al 100% del surnatante e conservarlo a meno 80 gradi Celsius durante la notte.
Per isolare la centrifuga del DNA virale a 9, 650 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante per ottenere un pellet di DNA e lavare il pellet tre volte con un millilitro di etanolo freddo al 70%. Centrifugare nuovamente a 9, 650 G per 15 minuti e scartare il surnatante.
Dopo aver asciugato all'aria il pellet per circa 10 minuti, risospendere il pellet in 10-50 microlitri di acqua distillata priva di nucleasi. Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius per l'elaborazione successiva o a quattro gradi Celsius durante la notte per garantire la massima dissoluzione del DNA, seguita dalla conservazione a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver pulito il piedistallo di un micro spettrofotometro con un delicato tergicristallo caricare un microlitro del campione di DNA preparato e notare la concentrazione del DNA nel campione.
Controllare i rapporti di assorbanza sia a 260 a 280 nanometri che da 260 a 230 nanometri. Il DNA assorbirà a 260 nanometri, le proteine a 280 nanometri e le sostanze organiche come il fenolo assorbiranno a 230 nanometri. Un rapporto di 1,8 a 2 è considerato sufficiente per la PCR in tempo reale.
Per preparare le miscele di reazione PCR, posizionare cinque microlitri di una miscela PCR in tempo reale cyber green in provette PCR da 0,2 millilitri. Aggiungere un microlitro di 7,5 moli pico per microlitro di primer in avanti e un microlitro di 7,5 moli pico per microlitro di primer inverso a ciascun tubo. Qui, il gene EBV small RNA 2 è amplificato.
Per determinare il numero di copie del genoma EBV. Quindi aggiungere due microlitri di acqua priva di nucleasi e un microlitro di DNA virale a una delle provette. Il volume totale della miscela di reazione è di 10 microlitri.
Preparare altre provette che verranno utilizzate come standard con numeri di copia del genoma EBV noti. Eseguire le miscele PCR iniziando con una fase iniziale di attivazione a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi 40 cicli a 95 gradi Celsius per 15 secondi e a 58 gradi Celsius per 30 secondi.
Esporta tutte le schede tecniche come file CSV e calcola il registro del numero di copie del genoma EBV per provetta standard e i valori medi CQ. Generare una curva standard qPCR tracciando i valori CT degli standard rispetto al log del numero di copie del genoma. Utilizzando l'equazione del grafico della curva standard, derivare il numero di copie del genoma EBV nella provetta PCR contenente il DNA virale indotto.
Infine, utilizzare la formula mostrata sullo schermo per calcolare la concentrazione della preparazione virale indotta. Qui X è il numero di copie del genoma EBV derivate dalla curva standard e F è il fattore di diluizione utilizzato per impostare il DNA per reazione PCR. Il conteggio delle cellule utilizzando una camera emocitometrica è mostrato qui.
Quattro quadranti vengono contati usando un microscopio ottico. Qui le celle indicate in blu dovrebbero essere contate, mentre le celle in rosso non dovrebbero essere contate, poiché toccano i bordi superiore, destro, inferiore o sinistro del quadrante. È stato eseguito uno studio di ottimizzazione per determinare le concentrazioni di PMA e dimetilsolfossido che produrrebbero il maggior numero di particelle EBV.
Una concentrazione di DMSO dello 0,8% e una concentrazione di PMA di 35 nanogrammi per microlitro sono state ottimali e hanno portato a concentrazioni elevate di EBV. Il nostro laboratorio ha utilizzato le particelle vitali prodotte da questa tecnica per esaminare le risposte autoimmuni o infiammatorie a questo virus. Oltre a sviluppare nuovi agenti anti-EBV.
