ستسمح لنا هذه الطريقة بعزل جزيئات فيروس Epstein Barr من خط الخلية P3HR1 وتحديد مخزون الفيروس بحيث يمكن استخدامه لأغراض بحثية مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة سهلة نسبيا وغير مكلفة وسريعة وموثوقة لإعداد مخزون فيروسي EB. يمكن استخدام الجسيمات الحيوية التي تنتجها هذه التقنية في العديد من النماذج التجريبية في المختبر أو في الجسم الحي لتشخيص EB.To البدء ، وإعداد حجم تعليق الخلية A في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ، وضبط الحجم بحيث يكون عدد الخلايا حوالي 2.2 مليون خلية للوحة ثقافة 100 ملم.
أضف خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع الكامل إلى الأنبوب. أضف 80 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى الأنبوب. ثم أضف 350 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر PMA إلى الأنبوب.
يجب أن يكون التركيز النهائي ل PMA 35 نانوجرام لكل ملليلتر ، ويجب أن يكون تركيز DMSO 0.08٪أضف 4.27 ملليلتر من وسط الاستزراع بحيث يكون الحجم الكلي 10 ملليلتر. امزج محتويات الأنبوب عن طريق الإمالة ، ثم انقل المحتويات إلى لوحة استزراع 100 ملم. اترك اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة خمسة أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد خمسة أيام في حاضنة الطرد المركزي محتويات لوحة في 120 G لمدة ثماني دقائق لبيليه الخلايا جمع الفيروس خالية من الخلايا التي تحتوي على طاف وتجاهل بيليه الخلية. مرة أخرى الطرد المركزي للطافي في 16،000 G لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية لحبيبات جزيئات الفيروس. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الفيروس في خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع ، وقم بتقسيم المعلق الفيروسي إلى 20 أنبوبا يحتوي كل منها على 250 ميكرولتر من المعلق الفيروسي ، وقم بتخزين المعلق عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
لفصل البروتينات عن الحمض النووي ، أضف 500 ميكرولتر من الفينول المشبع ب Tris إلى أحد الأنابيب التي تحتوي على المستحضر الفيروسي. أضف 100 ميكرولتر من الماء وبئر دوامة للحصول على مستحلب وردي. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 9،650 G ، وجمع الطافي ونقله إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 ملليلتر.
أضف ما يعادل عشر حجم الطافت من أسيتات الصوديوم الباردة واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ثم أضف ميكرولتر واحد من 20 ملليغرام لكل ملليلتر من الجليكوجين ، واخلطه عن طريق سحب العينات. أضف ثلاثة أضعاف حجم المادة الطافية من الإيثانول البارد بنسبة 100٪ وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل.
لعزل جهاز الطرد المركزي للحمض النووي الفيروسي عند 9،650 G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية للحصول على حبيبات الحمض النووي واغسل الحبيبات ثلاث مرات بملليلتر واحد من الإيثانول البارد بنسبة 70٪. مرة أخرى الطرد المركزي في 9،650 G لمدة 15 دقيقة وتجاهل طاف .
بعد تجفيف الحبيبات بالهواء لمدة 10 دقائق تقريبا ، أعد تعليق الحبيبات في 10 إلى 50 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من النيوكلياز. قم بتخزين العينات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمعالجتها لاحقا أو عند أربع درجات مئوية طوال الليل لضمان أقصى انحلال للحمض النووي ، يليه التخزين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد تنظيف قاعدة مقياس الطيف الضوئي الدقيق باستخدام ممسحة مهمة دقيقة ، قم بتحميل ميكرولتر واحد من عينة الحمض النووي المعدة ولاحظ تركيز الحمض النووي في العينة.
تحقق من نسب الامتصاص في كل من 260 إلى 280 نانومتر ، و 260 إلى 230 نانومتر. يمتص الحمض النووي عند 260 نانومترا ، والبروتينات عند 280 نانومتر ، والمواد العضوية مثل الفينول تمتص عند 230 نانومتر. تعتبر نسبة 1.8 إلى 2 كافية لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.
لتحضير خلطات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع خمسة ميكرولتر من مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي الأخضر السيبراني في أنابيب PCR سعة 0.2 ملليلتر. أضف ميكرولترا واحدا من 7.5 بيكو مول لكل ميكرولتر برايمر أمامي وميكرولتر واحد من 7.5 بيكو مول لكل ميكرولتر من التمهيدي العكسي لكل أنبوب. هنا ، يتم تضخيم جين EBV RNA 2 الصغير.
لتحديد رقم نسخة جينوم EBV. ثم أضف ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز وميكرولتر واحد من الحمض النووي الفيروسي إلى أحد الأنابيب. الحجم الكلي لخليط التفاعل هو 10 ميكرولتر.
قم بإعداد أنابيب أخرى سيتم استخدامها كمعايير مع أرقام نسخ جينوم EBV المعروفة. قم بتشغيل مخاليط PCR بدءا من خطوة أولية للتنشيط عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم ٤٠ دورة عند ٩٥ درجة سلزية لمدة ١٥ ثانية، وعند ٥٨ درجة سلزية لمدة ٣٠ ثانية.
قم بتصدير جميع أوراق البيانات كملفات CSV واحسب سجل عدد نسخ جينوم EBV لكل أنبوب قياسي وقيم CQ المتوسطة. قم بإنشاء منحنى قياسي qPCR عن طريق رسم قيم التصوير المقطعي المحوسب للمعايير مقابل سجل عدد نسخ الجينوم. باستخدام معادلة مخطط المنحنى القياسية ، اشتق عدد نسخ جينوم EBV في أنبوب PCR الذي يحتوي على الحمض النووي الفيروسي المستحث.
أخيرا ، استخدم الصيغة الموضحة على الشاشة لحساب تركيز المستحضر الفيروسي المستحث. هنا X هو عدد نسخ جينوم EBV المشتقة من المنحنى القياسي ، و F هو عامل التخفيف المستخدم لإعداد الحمض النووي لكل تفاعل PCR. يظهر هنا عد الخلايا باستخدام حجرة مقياس الدم.
يتم حساب أربعة أرباع باستخدام المجهر الضوئي. هنا يجب حساب الخلايا المشار إليها باللون الأزرق ، بينما لا ينبغي حساب الخلايا باللون الأحمر ، لأنها تلامس الحدود العلوية أو اليمنى أو السفلية أو اليسرى للربع. تم إجراء تجربة تحسين لتحديد تركيزات PMA وثنائي ميثيل سلفوكسيد التي من شأنها أن تنتج أكبر عدد من جزيئات EBV.
كان تركيز DMSO بنسبة 0.8٪ وتركيز PMA البالغ 35 نانوجرام لكل ميكرولتر هو الأمثل وأدى إلى تركيزات EBV عالية. استخدم مختبرنا الجسيمات الحيوية التي تنتجها هذه التقنية لفحص استجابات المناعة الذاتية أو الالتهابية لهذا الفيروس. وكذلك لتطوير عوامل جديدة لمكافحة EBV.
