Новая наноэмульсионная вакцина имеет большие преимущества в тактике лечения заболеваний. Эти эффекты сведены к минимуму благодаря таким свойствам, как уникальный опухолевый шопизм, идентификация специфической тактики и низкая системная токсичность. Мы ожидаем, что протокол предоставит технические и теоретические подсказки для будущей разработки новых Т-клеточных пептидных вакцин для слизистой оболочки.
Начните с смешивания одного миллиграмма монофосфоролового липида А со 100 микролитрами ДМСО. Встряхните в течение пяти минут и оставьте растворяться на четыре часа при комнатной температуре. Количественно добавьте TWEEN 80 и I-OVA.
Смешайте компоненты и добавьте сквален. Далее в приготовленную смесь добавляют 100 микролитров раствора МПЛА. Чтобы приготовить наноэмульсионную вакцину, добавьте смешанный раствор в капли воды примерно на 70% от общего объема и осторожно перемешайте, чтобы получить прозрачную и легко текучую смесь.
Для анализов in vitro начните с оживления эпителиальных клеток BEAS2B. Включите водяную баню и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Быстро разморозьте замороженные флаконы с клетками на водяной бане, закаленной при температуре 37 градусов по Цельсию.
После размораживания быстро поместите клетки пипеткой в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте два миллилитра полной питательной среды. Центрифугируйте пробирку при 129 G в течение пяти минут. Удалите супинатант и ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах полной питательной среды.
После повторного центрифугирования клеток удалите супинатант и добавьте шесть миллилитров полной питательной среды, чтобы ресуспендировать клетки. Затем перенесите клетки в колбу для культивирования T25 и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в 5%-ном инкубаторе углекислого газа. Как только плотность клеток достигнет 80-90%, выбросьте питательную среду и дважды промойте клетки двумя миллилитрами PBS.
Добавьте один миллилитр 0,25% трипсина, чтобы переварить клетки в течение одной-двух минут. Когда наблюдается округление клеток, немедленно добавляют четыре миллилитра полной питательной среды для нейтрализации трипсина. Смешайте и аспирируйте образцы в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.
Центрифугируйте образцы при 129 г в течение пяти минут. Удалите супинатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре полной среды RPMI 1640. Используйте 20 микролитров клеточной суспензии для подсчета клеток и разбавьте клетки до 10 раз до пятых клеток на миллилитр.
Затем помещают ячейки BEAS2B с плотностью от 10 до четвертой ячейки на лунку в 96 луночных планшетах в 100 микролитрах полной среды RPMI 1640 и предварительно инкубируют планшеты в течение 24 часов, как показано ранее. По окончании инкубации выбросьте супинатант и добавьте по 100 микролитров RPMI 1640 в каждую лунку 96-луночной пластины. Добавьте по 100 микролитров наноэмульсии I-OVA, I-OVA, смешанную с BNE, и I-OVA, предварительно разбавленную полной питательной средой в различных конечных концентрациях с BNE в качестве контроля, и инкубируйте в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия.
Как только инкубация будет завершена, удалите среду и перенесите тарелку в темное место. Добавьте 90 микролитров полной питательной среды и 10 микролитров раствора CCK8 в каждую лунку планшета. Выдерживайте тарелку в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Измерьте поглощение каждой лунки на глубине 450 нанометров с помощью планшетного считывателя с ферментной меткой. Используйте 10-литровые наконечники пипеток для проведения назальной иммунизации мышей I-OVA, I-OVA плюс BNE и I-OVA NE в течение трех дней. Используйте BNE и PBA в качестве экспериментального контроля.
После этого вырежьте ножницами образцы тканей носа толщиной около трех миллиметров и поместите их в 4% параформальдегид. Удалите ткани легких и зафиксируйте нос и целые легочные ткани в 4% параформальдегиде в течение 24 часов. ТЭМ и АСМ используются для оценки основных характеристик поверхностного дзета-потенциала и размера частиц нановакцины.
Показаны размеры частиц, показатели полидисперсности, дзета-потенциалы и электрофорезная подвижность I-OVA NE в анализе стабильности мусина. Относительная жизнеспособность клеток BEAS2B составляет более 80% в культурах, подвергшихся воздействию различных концентраций пептидов I-OVA, BNE+I-OVA и I-OVA NE в течение 24 часов. В группе I-OVA EN не было явной токсичности слизистой оболочки, повреждения тканей, кровотечения или воспалительной клеточной инфильтрации.
Эпителиальные клетки BEAS2B захватили больше метеных FITC I-OVA NE, чем его водный раствор. Эффект замедленного высвобождения I-OVA NE in vitro был проанализирован с использованием системы IV-IS. Вакцина I-OVA NE имела эффект замедленного высвобождения по сравнению с водным раствором I-OVA.
В группе I-OVA NE процент выживаемости выше по сравнению с другими группами, а объем опухоли был значительно меньше, что позволяет предположить, что она имеет лучший эффект профилактической защиты, чем в других группах. В терапевтической модели среднее время выживания значительно различалось между разными группами. Объем опухоли в группе I-OVA NE был значительно меньше, чем в группе I-OVA.
В этой процедуре важно равномерное перемешивание смеси. В противном случае это снизит эффективность нановакцин.
