Этот протокол может предоставить другим исследователям прямые и эффективные экспериментальные подходы и подробные шаги для оценки эффективности клеточного ответа новых адъювантов вакцины. Он не только предоставляет исследователям конкретные методы клеточной оценки адъювантов, но также может разрушать методы экстракции, такие как болезнь БМ. Эти протоколы не только демонстрируют отсутствие токсичности и высокую клеточную доставку, но и предоставляют подробные процедуры для области оценки адъюванта.
Для начала включите водяную баню и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Затем, собрав трубку замороженных клеток L929 из жидкого азота, быстро разморозьте на водяной бане. После пипетки клеток в 15-миллилитровую стерильную центрифужную трубку добавляют два миллилитра ДМЭМ и хорошо перемешивают.
Центрифугирование образцов при 129 х г в течение пяти минут. И после выброса супернатанта добавьте два миллилитра DMEM для повторного суспендирования клеток. Центрифугируйте образцы снова.
А после выброса супернатанта добавляют шесть миллилитров полной среды DMEM для повторного суспендирования и переносят в квадратную колбу для культивирования T25 сантиметров в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа для культивирования в течение 48 часов. На 24 день после первичной иммунизации выведите мышей из комнаты для животных, поместите в стеклянную посуду и замочите в 75% спирте в течение пяти минут. Поместите трубки центрифуги на стойку для трубок центрифуги, пронумеруйте одноразовые чашки Петри и добавьте пять миллилитров PBS к каждой чашке Петри с помощью пипетки 10 миллилитров.
Сделайте шести-восьмисантиметровый разрез ножницами посередине левой вентральной стороны мыши. Разорвите кожу, чтобы обнажить брюшную стенку и найти длинную красную полоску селезенки. Далее поднимите брюшину на нижнюю сторону селезенки щипцами.
Разрежьте его и поверните вверх, чтобы обнажить селезенку. Поднимите селезенку щипцами. Отделите соединительную ткань под селезенкой офтальмологическими ножницами и удалите селезенку.
Поместите селезенку в чашку Петри, содержащую пять миллилитров PBS, и измельчите с помощью сита и шприцевого плунжера. После измельчения переложить жидкость в 15-миллилитровую центрифужную трубку с пипеткой в соответствии с нумерацией. Затем центрифугируйте жидкость при 453 х г в течение пяти минут.
А после выброса супернатанта добавьте в каждую трубку три миллилитра буфера лизиса эритроцитов. Повторно суспендировать клетки и лизировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте от 10 до 12 миллилитров PBS в каждую трубку.
А после смешивания и центрифугирования при 453 х г в течение пяти минут отбросьте надосадочный агент и добавьте 10 миллилитров PBS в каждую трубку центрифуги и повторно суспендируйте клетки. Возьмите 20 микролитров каждого образца в колодце счетной пластины и запишите количество живых клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток. Затем центрифугируйте образцы при 453 х г в течение пяти минут.
А после выброса супернатанта разбавляют до 2,5 х 10 до шестых ячеек на миллилитр средой RF10 и добавляют в 96-луночную пластину по 100 микролитров на лунку. Вырежьте ножницами разрез на шесть-восемь сантиметров ниже брюшка мыши и зажмите два конца отверстия, чтобы отделить его в разные стороны и обнажить ноги мыши. Отделите бедренную кость мыши от тела мыши и большеберцовую кость от сустава.
И держите кости нетронутыми на обоих концах. Далее удаляют остаточную ткань и хрящи из суставных суставов на обоих концах бедренной кости ножницами и щипцами. Замочите бедренные кости в 75% спирте в течение пяти минут, а затем замочите в стерильном растворе PBS, чтобы смыть поверхностный спирт.
Затем ножницами срезают концы бедренных костей и ополаскивают костный мозг в стерильной чашке Петри стерильным раствором PBS с последующим аспирацией одним миллилитровым шприцем. Повторите стирку три-пять раз. Затем отфильтруйте клеточным ситом и соберите дендритные клетки, полученные из костного мозга, в 15-миллилитровую центрифужную трубку.
После центрифугирования образцов при 290 х г в течение пяти минут выбрасывают супернатант и добавляют четыре миллилитра буфера лизиса эритроцитов, повторно суспендируют и лизируют при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее добавляют 10 миллилитров стерильного раствора PBS для нейтрализации лизата, а после центрифугирования при 290 х г в течение пяти минут отбрасывают супернатант. Повторно суспендируют клетки в одном миллилитре DMEM, содержащем 1% раствора пенициллина-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки и количества.
Затем добавьте гранулоцитарный макрофаг, стимулирующий колониестимулирующий фактор плюс интерлейкин-4 в среду. Отрегулируйте концентрацию клеток до 5 х 10 до пятого на миллилитр и привите ячейки на крышках. После добавления клеточной суспензии к шестилуночной пластине по два миллилитра на лунку поместите пластину в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48 часов.
Полностью измените среду через два дня и измените половину среды через четыре дня. Погрузите мышей в 75% алкоголя после эвтаназии и поместите их лицевой стороной вверх в стеклянную чашку Петри в пронумерованном порядке. Пропустите мышей через трансферное окно в стерильную операционную и положите их на операционный стол на пять минут.
Используя шприц, аспирировать 10 миллилитров физиологического раствора. Наклоните мышей вниз примерно на 45 градусов и введите в середину брюшной полости. Втяните около пяти миллилитров клеточной суспензии в 15-миллилитровую центрифужную трубку на каждые 10 миллилитров и повторите инъекцию три раза.
Центрифугируют клеточную суспензию при 129 х г в течение пяти минут для получения перитонеальных первичных макрофагов мыши. Фибробласты L929 являются полезной моделью скрининга для тестирования токсичности NOD in vitro. Количественная оценка уровней воспалительных цитокинов в селезенке может помочь исследователям лучше понять иммунный ответ.
Мониторинг цитотоксических Т-лимфоцитов с помощью иммуноферментного пятна является золотым стандартом для оценки антиген-специфического Т-клеточного иммунитета в клинических испытаниях и для скрининга кандидатов на вакцину. Повышенное поглощение антигена дендритными клетками может вызвать усиленные адаптивные иммунные реакции. Макрофаги играют важную роль в представлении антигенов Т-клеткам, а также в индуцировании других антигенпрезентирующих клеток к экспрессии костимулирующих молекул, тем самым инициируя адаптивные иммунные реакции.
Выделение клеток при соотношении действия препарата к клеточному имеет первостепенное значение.
