В связи с сокращением тестирования на животных и изменчивостью теста NH ВОЗ рекомендует разработать подходы в пробирке для оценки потенции вакцины против бешенства. Этот тест ELISA показывает хорошее согласие с классическим тестом NH в признании иммуногенной формы гликопротеина, показывает высокую чувствительность, и может быть выполнен в течение одного дня. Оценка потенции вакцины против бешенства в пробирке ELISA является альтернативой тесту In vivo NH.
Он продвигается производителями и национальными лабораториями контроля. Очень важно распределить предварительно размера объемов в дубликат для каждого разбавления и хорошо высушить пластину на абсорбирующим бумаге после моет, чтобы избежать, чтобы начать эту процедуру, надеть адекватное оборудование личной защиты, включая одноразовые пальто, перчатки, маски и очки. Лечить загрязненные материалы, погружая его в раствор 2,6% гипохлорита натрия в течение 30 минут для обеззараживания.
Затем установите 96-хорошо иммуноанализной пластины и добавить 200 микролитров моноклональных антител, разбавленных в карбонат буфера для каждой хорошо. Обложка пластины с клейкой пленкой и инкубировать микроплюрат при 37 градусов по Цельсию в течение трех часов во влажной среде. Затем тщательно аспирировать и передать содержимое хорошо в получателя, содержащего раствор 2,6% гипохлорита натрия.
Переверните микроплотину и дайте ей высохнуть на абсорбющей бумаге при комнатной температуре в течение пяти минут. Во-первых, добавьте 300 микролитров буфера пассивации к каждой колодец. Накройте пластину клейкой пленкой и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
После этого перенесите содержимое колодец в раствор 2,6% гипохлорита натрия. Чтобы вымыть тарелку, добавьте 300 микролитров стирального буфера к каждому хорошо. Затем аспирировать тщательно и передать содержимое колодец в получателя, содержащего раствор 2,6% гипохлорита натрия.
Повторите этот процесс стирки еще пять раз, чтобы тщательно вымыть сенсибилизированную тарелку. После этого переверните микропластить и дайте ему высохнуть на куске абсорбянтной бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты. Восстановить эталонную вакцину в одном миллилитре дистиллированной воды таким образом, чтобы окончательная концентрация вируса бешенства гликопротеина составляет 10 микрограмм на миллилитр.
Подготовка 10-кратного разбавления восстановленной эталонной вакцины в разбавлении для достижения концентрации гликопротеина вируса бешенства в один микрограмм на миллилитр. Далее выполните шесть серийных двукратных разбавления этой эталонной вакцины в разбавлении, изложенном в таблице одного из текстовых протоколов. Распространение 200 микролитров разбавляя в дублирующих скважинах в качестве слепого контроля и 200 микролитров на скважину для каждого эталонного разбавления вакцины в дубликате.
Затем подготовьте 10-кратное разбавление тестуемой вакцины в разбавлении и подготовьте семь двукратных серийных разбавлений испытанной вакцины разбавлением, как указано во второй таблице текстового протокола. Распространение 200 микролитров каждой испытанной вакцины разбавления в дубликат к каждой колодец микроплюта. Обложка микроплюрат с клейкой пленкой и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.
После этого снимите пленку. Аспирировать тщательно и передать содержимое каждого хорошо в получателя, содержащего 2,7% гипохлорита натрия раствор. Чтобы вымыть пластину, добавьте 300 микролитров стирального буфера к каждой хорошо, аспирировать тщательно и передать содержимое каждого хорошо в получателя, содержащего 2,6% гипохлорита натрия раствор.
Повторите процесс стирки еще пять раз, чтобы удалить несвегаемый антиген и сохранить G-белковые тримеры, связанные с покрытым антителом. Переверните промытую микроплюй и дайте ей высохнуть на куске абсорбянтной бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты. Затем распределите 200 микролитров рекомендуемого разбавления пероксидазы помечены моноклональным антителом D1 в разбавлении каждой хорошо.
Обложка микроплюрат с клейкой пленкой и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Затем удалите пленку, аспирировать тщательно, и передать содержимое каждого хорошо в получателя, содержащего 2,6% гипохлорита натрия раствор. Для мытья микроплюта добавьте в каждую колодец 300 микролитров стирального буфера.
Аспирировать тщательно и передать содержимое каждого хорошо в получателя, содержащего 2,6% гипохлорита натрия раствор. Повторите этот процесс стирки еще пять раз, чтобы удалить несвехую пероксидаза помечены антитела. Переверните промытую микроплюй и дайте ей высохнуть на куске абсорбянтной бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты.
Затем распределим по 200 микролитров субстратно-хромогенного раствора в каждую колодец. Запечатать микроплюй с пленкой и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Затем добавьте 50 микролитров раствора остановки в каждый колодец, чтобы остановить реакцию.
Аккуратно протрите дно микроплюта и поместите его в спектрофотометр. Определите оптическую плотность на уровне 492 нанометров для всех используемых скважин. Соберите эти данные в файле электронной таблицы для анализа.
После этого создайте участки как для кривой эталонной вакцины, так и для значений оптической плотности, изложенных в текстовом протоколе. В этом исследовании, тест in vitro ELISA используется для оценки потенции вакцины против бешенства. Здесь показаны репрезентативные оптические значения плотности из типичного эксперимента.
Эти значения используются для построения эталонной кривой вакцины путем построения средней оптической плотности для различных разбавлений эталонной вакцины на вертикальной оси и концентрации гликопротеина на горизонтальной оси. Содержание гликопротеина в тестуемой вакцине затем оценивается с помощью этой кривой. Оценка точна для разбавления, которые имеют среднее значение оптической плотности в области лайнера кривой эталонной вакцины.
С учетом разбавления от одного до 40 вертикальная проекция OD 1534 на х-оси соответствует 500 нанограммам на миллилитр. Таким образом, протестированная вакцина оценивается в 20 микрограмм на миллилитр гликопротеина. При установке потенции in vitro необходимо сравнить испытанную вакцину со ссылкой на шесть международных стандартов ВОЗ, откалиброванных в международных подразделениях.
Тот же метод может быть использован с другими антителами, чтобы увеличить обнаружение большего количество штаммов вакцин, включая те, которые используются в ветеринарных вакцинах, которые классически более изменчивы. Антитела также могут быть использованы в конкуренции за титрован антирабии антител в конной или человеческой сыворотке. Меры предосторожности должны быть приняты с вакцинами, которые не инактивированы или с вирусами.
Обязательно используйте средства индивидуальной защиты, носите перчатки и обеззараживать все должным образом. Кроме того, будьте осторожны с таблетками, поскольку они являются канцерогенными и с кислым раствором гипохлорита натрия.
