Этот протокол поможет исследователям, новичкам в работе с аптамерами, иметь возможность использовать их в своих проектах, а также понимать отдельные маленькие шаги, необходимые для завершения протокола. Аптамеры очень универсальны, и этот протокол демонстрирует, насколько они легки и просты в иммунофенотипическом анализе. Аптамеры могут использоваться как для диагностических, так и для терапевтических применений.
Этот протокол является первым шагом, предпринятым для подтверждения их специфики и чувствительности. В то время как этот конкретный анализ демонстрирует окрашивание рецептора одной клеточной поверхности, аптамеры могут очень легко использоваться для многопараметрической проточной цитометрии, обеспечивая высокий уровень фенотипических знаний. Важными аспектами работы с аптамерами являются обеспечение того, чтобы они были правильно сложены перед использованием, а также чтобы условия буфера и ионной силы были такими же, как при их выборе.
После сбора и выбрасывания среды в колбу добавьте три миллилитра PBS и распределите их по клеткам. После добавления одного миллилитра 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую колбу инкубируют в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия и визуализируют отслоение клеток под микроскопом. Затем добавьте один миллилитр полной среды к ячейкам и пипеткой клетки вверх и вниз, чтобы сделать одноклеточную суспензию.
Пипетка клеток в соответствующую трубку и центрифугу при 200 Г в течение пяти минут. После выброса супернатанта повторно суспендируют клетки в одном миллилитре свежей среды и подсчитывают клетки с помощью окрашивания трипановым синим цветом, разбавляя определенный объем клеточной суспензии трипан-синим. Распределите примерно 15 микролитров смеси между гемоцитометром и покровным стеклом для подсчета клеток.
Соберите необходимое количество клеток, убедившись, что на тестовый образец приходится сто тысяч клеток. Затем инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия в течение двух часов, чтобы обеспечить стабилизацию белка, представляющего интерес, на клеточной мембране после ферментативной отслойки. После двухчасовой инкубации центрифугируют клетки при 500 г в течение пяти минут.
После выброса супернатанта повторно суспендируют клетки в 500 микролитрах блокирующего буфера. Инкубируйте клетки при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут с прерывистым перемешиванием. Во время этой 30-минутной инкубации выполните складывание аптамера, приготовив в два раза больше концентраций аптамеров, как описано в рукописи.
Затем смешайте и инкубируйте аптамеры с термоциклерной машиной в соответствии с требуемыми условиями складывания, обеспечивая при этом защиту аптамеров от света. После 30-минутной инкубации центрифугируйте клетки, как показано ранее, и удалите супернатант. Затем добавьте один миллилитр промывочного буфера и снова центрифугируйте клетки.
После удаления супернатанта повторно суспендируйте клетки в подходящем объеме связывающего буфера. Далее пипетка 50 микролитров повторно суспендированных ячеек в каждую лунку ледяного холода 96 лунок черной пластины. Затем пипетку 50 микролитров аптамеров на 50 микролитров объема клеток, перемешайте и высиживайте в темноте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.
После центрифуги и удаления супернатанта тщательно повторно суспендировать гранулу в буфере промывки и снова центрифугу при 500 Г в течение пяти минут. Затем повторно суспендировать в 100 микролитрах промывочного буфера для проточного цитометрического анализа, повторив этап промывки дважды. Сначала включите проточный цитометр, а затем компьютер.
Затем откройте программное обеспечение для анализа проточной цитометрии, войдите в программу и под вкладкой цитометра запустите запуск жидкости. Чтобы создать новый эксперимент, на вкладке эксперимент щелкните Новая папка и назовите эксперимент косой черты папки соответствующим образом. Нажмите на новую папку, чтобы выделить ее.
Затем на вкладке эксперимент снова щелкните Новый эксперимент и назовите его соответствующим образом. Чтобы добавить первый образец косой черты, на вкладке эксперимента щелкните новый образец и назовите образец соответствующим образом. Чтобы добавить образец пробирки, выделите образец и под вкладкой эксперимента щелкните Новая трубка.
Затем добавьте соответствующее количество трубок и название. Чтобы подготовить необходимые графики, на вкладке листа откройте новый лист. Как только появится новое окно листа, подготовьте точечный график бокового рассеяния и прямого рассеяния, чтобы выбрать интересующую популяцию.
Подготовьте точечный график высоты прямого рассеяния и области прямого рассеяния, чтобы выбрать популяцию одной ячейки. Далее подготовьте гистограмму количества событий против интересующего флуорофора. Перед началом проточной цитометрии убедитесь, что перед началом проточной цитометрии открыта панель сбора для управления сбором образцов, инспектор и цитометр для регулировки параметров напряжения, а также рабочий лист со всеми графиками.
Во-первых, запустите необработанные клетки. Убедитесь, что стрелка, указывающая на трубку, зеленая. Если эта стрелка не зеленая, нажмите на стрелку, чтобы сделать ее зеленой.
Используя пипетку, перенесите каждый образец из черной пластины из 96 скважин в проточную цитометрическую трубку. На панели мониторинга сбора выберите соответствующее количество событий для записи, измените скорость потока на низкую и нажмите кнопку Получить данные. Отрегулируйте напряжение для параметров FSC и SCC, гарантируя, что популяция клеток централизована внутри точечного графика и что ни одна ячейка не касается ни одной оси графика, чтобы избежать потери интересующих ячеек.
Определите первые ворота, определив и выбрав интересующую популяцию на прямом и боковом участке рассеянной плотности, исключив при этом обломки, которые составляют популяцию с наименьшим сигналом прямого рассеяния. Определите второй вход, исключив популяции дублетных клеток, так как дублетные клетки значительно влияют на результаты и выводы. Увеличьте скорость сбора данных до средней или высокой, чтобы анализировать образцы быстрее, но не превышать более 200-300 событий в секунду.
Затем нажмите кнопку Записать данные. После регулировки напряжения и блокировки и записи данных, извлеките образец и нажмите Next Tube. Вставьте следующий образец и повторите запись данных для всех контрольных и тестовых образцов.
После того, как все данные собраны, промыть проточный цитометр, запустив три трубки с 50% отбеливателем, FACSRinse и сверхчистой водой, каждая в течение пяти минут с высокой скоростью потока. Затем в раскрывающемся меню цитометра щелкните Fluidics shut down. Экспортируйте результат в виде FSC-файлов на USB-накопитель для передачи.
Проанализируйте их с помощью программного обеспечения для анализа, нажав кнопку new, чтобы создать новый документ и окно для обработки анализа, и перетащите файлы образцов в новое окно. Дважды щелкните, чтобы открыть незапятнанный образец. Чтобы определить популяцию с одной клеткой, выберите популяцию P1 и дважды щелкните на популяции P1, чтобы создать график FSCH против FSCA.
Дважды щелкните по закрытым одиночным ячейкам, чтобы создать гистограмму событий против используемого фторхрома. В исходном окне выберите P1 и отдельные ячейки и перетащите их на все образцы, чтобы все образцы теперь содержали один и тот же затвор. Затем нажмите кнопку редактора макетов, чтобы открыть окно макетов, и перетащите два образца друг на друга, чтобы создать гистограмму наложения.
В клетках EpCAM с положительным MDA-MB-231 наложение гистограмм, представляющих клетки, обработанные TEPP и TENN, показывает, что клетки, обработанные TEPP, смещены вправо по сравнению с клетками, обработанными TENN, демонстрируя, что связывание аптамера TEPP происходит с интересующим белком. В отрицательном контроле клетки HEK 293T, накладывающие гистограммы TEPP и TENN, не отражают какого-либо сдвига, указывающего на то, что в EpCAM-экспрессирующих клетках TEPP является аптамером EpCAM, прикрепленным к его рецептору. Кроме того, в отрицательных клетках EpCAM не наблюдалось связывания, что подтверждает селективность и специфичность разработанного аптамера.
Убедитесь, что аптамеры защищены от света, аптамеры и клетки смешаны на пластине, а на проточном цитометре установлены правильные напряжения. Это сильно зависит от будущих применений аптамеров. Например, мы ориентированы на доставку лекарств.
Таким образом, следующим шагом для нас будет оценка того, интернализуются ли аптамеры с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот протокол продемонстрировал, насколько легко аптамерам заменить моноклональные и поликлональные антитела в иммунофенотипических анализах.
