Пиросеквенирование - это метод секвенирования путем синтеза, который может быть использован для генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов в митохондриальной ДНК. Этот метод отличается простотой внедрения и экономичностью по сравнению с другими методами секвенирования. Он может быть легко использован в качестве метода диагностики некоторых митохондриальных заболеваний путем определения значений гетероплазмии патогенных вариантов в митохондриальной ДНК.
Для начала получите файл последовательности митохондриальной ДНК для генотипируемого вида и определите положение однонуклеотидного полиморфизма или SNP. Убедитесь, что используемая эталонная последовательность использует соответствующую базовую нумерацию для изучаемой мутации, чтобы можно было легко идентифицировать положение SNP. Скопируйте 1 000 пар оснований вверх и вниз по течению от сайта SNP и вставьте усеченную последовательность в программное обеспечение для проектирования пиросеквенирующей грунтовки.
Выделите полиморфное основание, щелкните его правой кнопкой мыши и выберите «Установить целевую область», чтобы установить проанализированное основание SNP в качестве цели анализа пиросеквенирования. Нажмите значок «Воспроизвести» в правом верхнем углу интерфейса, чтобы запустить выбор праймера, и подождите, пока программа автоматически сгенерирует трио праймеров, два праймера для предварительной амплификации матричной ДНК и третий праймер для секвенирования путем синтеза в пиросеквенирующей машине. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Копировать все наборы учебников», чтобы сохранить все наборы учебников.
Откройте программное обеспечение для запуска, поставляемое с пиросеквенсором, выберите «Новый анализ», затем выберите шаблон анализа количественного определения аллелей. Введите последовательность, подлежащую анализу, в соответствующее поле, введя нуклеотиды непосредственно после праймера секвенирования. Для переменной позиции обозначьте два возможных основания, разделенных косой чертой.
Нажмите «Создать порядок диспенсации» и позвольте программному обеспечению автоматически определить подходящий порядок для нуклеотидов, которые будут распределяться в секвенировании по реакции синтеза. Сохраните и укажите имя для анализа. Затем выполните прогон, разбавив анализируемую ДНК до 5 нанограммов на микролитр.
В первом прогоне убедитесь, что в качестве эталона включены образцы известной гетероплазмии и образцы дикого типа. Затем проводят пресеквенирование ПЦР 5 микролитров разбавленной ДНК и 25 микролитров реакций, используя амплификационные праймеры и параметры. Чтобы запустить настройку файла, выберите «Новый запуск» в программном обеспечении пиросеквенсора.
Пиросеквенсор может одновременно секвенировать 48 отдельных предварительно усиленных реакций с пустым квадратом, представляющим собой одну секвенирующую яму на пиросеквенирующем диске. Загрузите анализы, щелкнув правой кнопкой мыши квадрат и выбрав «Загрузить анализ». При необходимости секвенируйте до четырех отдельных анализов с разными праймерами секвенирования.
Установите автоматический режим выдачи праймера, чтобы автоматически назначать камеру впрыска для каждого праймера секвенирования, используемого для прогона. Установите стандартный режим выполнения, если на одном диске секвенирования не выполняется четыре разных типа анализов. Убедитесь, что количество анализов в файле шаблона запуска совпадает с количеством амплируемых реакций ПЦР.
Затем сохраните запущенные файлы на USB-накопитель. Чтобы заправить пиросеквенсор, нажмите кнопку очистки на главном сенсорном экране устройства и очистите все форсунки водой высокой чистоты, следуя инструкциям на экране. Вставляя полосу амортизатора в машину, убедитесь, что концы сходятся в положении «9 часов».
После подключения USB-накопителя нажмите кнопку «Последовательность», чтобы загрузить подготовленные ранее файлы запуска. Следуйте инструкциям на устройстве, чтобы загрузить и заправить реагенты, по мере необходимости, в соответствующие форсунки на машине. Загрузите 3 микролитра шариков в лунки, а затем загрузите 10 микролитров каждой реакции ПЦР для секвенирования в соответствующий образец.
Пипеткой вверх и вниз, чтобы смешать образец с магнитными шариками. Ищите в загрунтованном пиросеквенсоре индикацию того, что диск может быть загружен в машину. Отвинтите пластину, удерживающую гайку, и совместите загруженную пластину образца с металлическим штифтом в отсеке диска.
После того, как пластина плотно ввинчена в отсек пластины, запустите последовательность, нажав кнопку запуска на сенсорном интерфейсе. После завершения запуска извлеките USB-накопитель из машины и снова подключите его к компьютеру, на котором запущено программное обеспечение пиросеквенсора. После того, как только что сгенерированный файл запуска появится на USB-накопителе, дважды щелкните файл результата запуска.
Это автоматически анализирует выход люциферазы из каждой лунки при включении нуклеотидов и количественно определяет интересующий митохондриальный аллель. Ищите цветовые показатели, отображаемые программным обеспечением, в зависимости от качества чтения. Чтобы сохранить результаты, выберите «Отчеты» в верхнем окне, а затем «Полный отчет», чтобы создать PDF-файл, содержащий пирограммы и результаты из каждой скважины прогона.
Кроме того, вы можете загрузить результаты в других форматах на вкладке «Отчеты». Электрофорез в агарозном геле амплификации ПЦР с использованием амплификационных праймеров из обоих наборов, выбранных для мутации m. 3243A>G, как показано на этом рисунке.
Здесь Het обозначает почти гомоплазматический образец m. 3243A>G, подлежащий анализу. На этом рисунке показано сравнение характеристик обоих наборов праймеров с использованием молярных эталонов для калибровки.
Измеренные значения обозначаются вертикальными пунктирными линиями. Линейная функция X = Y отображается, чтобы проиллюстрировать, насколько близок каждый из двух тестируемых анализов к идеальному измерению. Названия клеточных линий по оси X — это названия различных клонов кибридов, которые были генотипированы с помощью этого анализа.
Здесь показаны результаты генотипирования четырех клонов цибридов неизвестной гетероплазмии m. 3243A>G с использованием обоих анализов. Секвенирование проводили в техническом трипликате.
Здесь показаны результаты генотипирования митохондриальных клеток, обработанных нуклеазой цинкового пальца, наряду с необработанными и имитационно обработанными контрольными группами, а также пирограммы из двух реплик ПЦР-образцов клеток MEF, использованных для получения результатов, а также контроль генотипирования дикого типа. Пиросеквенирование может быть использовано в качестве считывания для экспериментов по генной терапии для оценки различных технологий генной терапии в митохондриальной ДНК.
