Кибергенерация по-прежнему является современным протоколом для понимания патогенной роли любой новой мутации митохондриальной ДНК и корреляции процента атриплазмы с тяжестью заболевания. Данная методика позволяет проводить биохимическое исследование в однородной ядерной системе, в которой отсутствует вклад ядерного фона пациента. Этот метод позволяет проверить патогенность мутации митохондриальной ДНК.
и дает возможность изучить его влияние на биохимическом уровне Мыть 35-миллиметровую посуду, содержащую фибробласты, дважды, используя два миллилитра 1X PBS без кальция и магния. Очистите внешнюю поверхность посуды 70% этанолом, и подождите, пока спирт испарится. Снимите крышки с посуды и завинчивающиеся крышки с бутылок.
Поместите каждое блюдо без крышки вверх ногами на дно каждой бутылки центрифуги объемом 250 миллилитров. Медленно добавляйте 32 миллилитра нуклеационной среды в каждую бутылку, позволяя среде войти в чашку и войти в контакт с клетками. Удалите все пузырьки с посуды с помощью длинной стеклянной пастбищной пипетки, искривив кончик в пламени Бунзена.
Закройте каждую бутылку винтовой крышкой и перенесите их в центрифугу. Центрифуга в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и 8 000 х Г.Аспирируйте среду из бутылок и выбрасывайте ее. Снимите посуду, перевернув флаконы на стерильной марле, предварительно опрысканной 70% этанолом.
Очистите внешнюю поверхность посуды и ее крышек 70% этанолом и закройте посуду после того, как этанол испарится. Перед началом проверьте образование цитопласта с помощью инвертированного микроскопа для живых клеток. Ищите чрезвычайно вытянутые фибробласты из-за экструзии их ядер, индуцированных цитохалазином.
К каждой 35-миллиметровой тарелке добавьте 1 000, 143 рядных нулевых ячеек. Повторно суспендируется в двух миллилитрах питательной среды, дополненной 5% FBS. Оставьте посуду на три часа в увлажненном инкубаторе углекислого газа, чтобы поселить 143 рядные нулевые клетки на призраках.
После трех часов инкубации аспирировать и выбросить среду. Дважды промыть клетки адгезии двумя миллилитрами среды DMEM с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или MEM, затем аспирировать и выбросить среду. Добавьте в клетки 500 микролитров раствора полиэтиленгликоля и инкубируйте ровно одну минуту.
Аспирировать и выбросить раствор полиэтиленгликоля. Промыть клетки три раза двумя миллилитрами ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или с ПОМОЩЬЮ МЭМ. Добавьте два миллилитра термоядерной среды и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.
Попробуйте клетки в оставшихся чашках культуры Подсчитайте их и посейте в одну или несколько чашек Петри Добавьте от 50 до 100 клеток на чашку в дополненной культуре, пока не появятся клоны. Затем дайте им расти в течение нескольких дней. С помощью стереомикроскопа подберите клонов из чашки Петри с помощью клонирующих цилиндров или наконечника пипетки.
Старайтесь избегать объединения различных клонов и переносите их на плиту из 96 скважин, каждая из которых содержит 200 микролитров дополненной питательной среды. Цибриды были получены, начиная с фибробластов, полученных от пациента, несущего гетероплазматический M2343A2G Одна из наиболее распространенных мутаций митохондриальной ДНК, связанных с митохондриальной миопатией, энцефалопатией, лактоацидозом и инсультоподобными эпизодами. Анализ переменного числа тандемных повторов показал, что кибер-ДНК идентична нулевым клеткам ряда, что подтверждает замену кибер-ДНК пациента геномом 143 B.
Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента, или анализ секвенирования, может быть использован для оценки наличия мутации митохондриальной ДНК и процента гетероплазмы. При попытке этого протокола важно проверить правильный генетический актив нуклонной и митохондриальной ДНК, а также количество митохондриальной ДНК в повторно заселенных цибридах.
