Этот протокол имеет большое значение, поскольку он позволяет исследователям сообразовывать коммерческие или собственные hiPSC-CM до взрослого фенотипа, что значительно повышает прогностическую ценность hiPSC-CM при скрининге кардиотоксичности. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он доставляет зрелые hiPSC-CM в формате с высокой пропускной способностью для оптического картирования кальция или изменения напряжения. Этот протокол может быть использован для исследования механизмов заболевания или для скрининга лекарств на кардиотоксичность.
Продемонстрирует процедуру Джеффри Крич, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с двухкратного промывания планшетов внеклеточного матрикса, вызывающего созревание, или MECM, 200 микролитрами сбалансированного солевого раствора Хэнка, или HBSS, за 1 час до покрытия кардиомиоцитов. Следите за тем, чтобы лунки были увлажнены.
Перенесите кардиомиоцитарные пробирки из резервуара с жидким азотом в сухой лед и сбросьте давление, слегка приоткрыв крышки пробирок. Затем снова запечатайте крышки тюбиков и разморозьте их на водяной бане в течение 4 минут. После оттаивания ячеек опрыскайте пробирки 70% этанолом, прежде чем открывать их.
Перенесите клетки в конические пробирки объемом 15 миллилитров с помощью пипетки объемом 1 миллилитр. Добавьте 1 миллилитр гальванической среды в криовиал и перенесите промывку в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Затем медленно капните 1 миллилитр гальванической среды и перемешайте трубку.
Повторяйте это до тех пор, пока не перенесут 8 миллилитров гальванической среды. Центрифугируйте 15-миллилитровую пробирку при 300 x g в течение 5 минут и ресуспендируйте гранулу в 1 миллилитре гальванической среды. Удалите аликвоту и выполните подсчет живых клеток с помощью гемоцитометра перед добавлением гальванической среды, чтобы получить 7,5 x 10 к 5-м клеткам на миллилитр.
Распределите 100 микролитров клеточной суспензии на лунку 96-луночной пластины с покрытием MECM с помощью многоканальной пипетки и инкубируйте клетки в течение 2 дней. Затем замените среду на 200 микролитров поддерживающей среды и выдержите пластины в течение 7 дней, со сменой среды на 5-й день. На 7-й день проведите анализ ЭП, как описано в тексте.
Убедитесь, что вы меняете среду через день, когда выбираете расширение клеточной культуры. Чтобы очистить hiPSC-CM с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток, или MACS, аспирируйте среду для культивирования клеток и промойте клетки 1 миллилитром HBSS-Затем диссоциируйте клетки, добавив 1 миллилитр 0,25% трипсина-этилендиаминтетрауксусного или ЭДТА и инкубируя клетки в течение 10 минут. Затем инактивируйте трипсин / ЭДТА, повторно отправив и сингуляризировав клетки 2 миллилитрами гальванической среды.
Из шести лунок соберите клетки в коническую трубку объемом 50 миллилитров с помощью 70-микрометрового ситечка. Промыв ситечко 3 миллилитрами гальванической среды, посчитайте ячейки. После подсчета центрифугируют и промывают гранулы клеток 2 миллилитрами ледяного разделительного буфера MACS перед гранулированием и повторной отправкой клеток в 80 микролитров холодного разделительного буфера MACS на 5 x 10 в 6-ю ячейку.
Добавьте 20 микролитров холодного коктейля без истощения кардиомиоцитов и перемешайте суспензию перед инкубацией на льду в течение 10 минут. После промывки ячеек 4 миллилитрами холодного разделительного буфера MACS при 300 x g в течение 5 минут ресуспендируйте гранулу в 80 микролитрах холодного разделительного буфера MACS. Добавьте 20 микролитров холодных микрогранул антибиотина в 5 x 10 к 6-й ячейке и аккуратно перемешайте клеточную суспензию перед инкубацией на льду в течение 10 минут.
Во время инкубации образцов поместите колонны положительного истощения, оснащенные 30-микрометровыми фильтрами предварительного разделения, на сепаратор MACS и поместите маркированные 15-миллилитровые сборные пробирки под колонны. Затем заправьте каждую колонку 3 миллилитрами холодного разделительного буфера MACS. Смешайте клеточную суспензию, обработанную антителами, с 2 миллилитрами разделительного буфера MACS и добавьте его в колонку.
Добавьте 2 миллилитра разделительного буфера MACS в каждую колонку и соберите 12 миллилитров проточной суспензии кардиомиоцитов. Центрифугируйте кардиомиоциты и выбросьте надосадочную жидкость перед ресуспендированием кардиомиоцитов в 1-миллилитровой гальванической среде. Чтобы определить концентрацию, подсчитайте клетки и отрегулируйте объем до желаемой плотности посева перед нанесением очищенных клеток кардиомиоцитов на 96-луночные планшеты MECM.
Аспирируйте и замените поддерживающую среду кардиомиоцитов 100 микролитрами чувствительных к напряжению красителей, или VSD, или кальций-чувствительных флуорофоров, или CSF, на лунку 96-луночной пластины. После 30 минут инкубации замените красители анализирующей средой или HBSS. Уравновесьте ячейки при 37 градусах Цельсия перед получением оптического картирования исходных данных с помощью высокопроизводительного оптического картографического устройства.
Чтобы обработать клетки лекарствами для тестирования на острое воздействие или составить карту клеток, хронически подвергающихся воздействию интересующих лекарств, разбавьте лекарства диметилсульфоксидом или ДМСО и храните их в виде исходных растворов при температуре 20 градусов Цельсия, прежде чем разбавлять их в HBSS до желаемых концентраций. Для тестирования кардиотоксичности в 96-луночных планшетах добавьте четыре дозы соединения, по крайней мере, с восемью лунками на дозу. Используйте дозы в диапазоне от ниже до выше клинически эффективной терапевтической концентрации в плазме, включая эффективную дозу.
Подобно базовым электрофизиологическим измерениям до применения препарата, запишите электрофизиологические записи не менее чем через 30 минут после лечения препаратом для хронических исследований. После исходной регистрации применяйте не менее четырех доз каждого лекарства к зрелым монослоям hiPSC-CM, экспрессирующим GCaMP6m, по крайней мере, с восемью лунками на дозу. Уравновесьте лекарства на клетках в течение 30 минут и нагрейте клетки до 37 градусов по Цельсию до и во время сбора данных.
После базовых записей всей пластины добавьте 500 наномолярных изопротеренолов в каждую лунку, чтобы получить надежные данные об ответе на лекарство и количественно оценить влияние изопротеренола на частоту биений монослоя, амплитуду сжатия и продолжительность переходного процесса кальция. Чтобы получить данные оптического картографирования, откройте передний ящик и установите пластину на нагреватель. Открыв программное обеспечение для сбора данных и определив место сохранения файла в программном обеспечении, выберите продолжительность сбора от 10 до 30 секунд и частоту кадров для более высокого временного разрешения и нажмите «Начать сбор».
Откройте программное обеспечение для анализа и на вкладке «Импорт фильтра» выберите «Обзор одного файла» или «Несколько плиток», чтобы восстановить пластину. Выберите файлы, введите несколько строк и столбцов и выберите Автоматически. Затем выберите «Обновить размер пикселя», введите расстояние на пиксель и используйте мастер скважин, чтобы определить местоположение скважин на изображении, прежде чем нажать «Сохранить процесс» и перейти на следующую вкладку.
Откройте вкладку ROI или «Области интереса» и выберите, рисовать ли ROI вручную, автоматически или вообще не использовать ROI, которые будут учитываться при анализе всей тарелки. После выбора области в колодце нажмите кнопку «Сохранить процесс», чтобы перейти к следующему шагу. Установите флажки «Скрыть колодцы» и «Показывать только отфильтрованные», чтобы визуализировать рентабельность инвестиций.
Откройте вкладку «Анализ», выберите каждую скважину или ROI, чтобы подтвердить точность автоматического определения ударов. Добавьте или удалите удары из трассировок, выбрав отдельный бит и нажав клавишу Delete на клавиатуре. После этого нажмите «Сохранить».
Затем нажмите кнопку «Пространственно-временной график» на вкладке «Анализ» и добавьте строку для определения пространственно-временного графика для визуализации данных для каждой скважины или окупаемости инвестиций. Выбрав горизонтальную или вертикальную линию, нажмите «Создать график». Убедившись в точном обнаружении ударов, перейдите на вкладку «Экспорт» и выберите «Формат файла», введите параметр «Статистика ударов», прежде чем нажимать «Экспорт».
После экспорта откройте файлы данных и запустите выбранную процедуру статистического анализа. Фазово-контрастная визуализация показала, что hiPSC-CM, нанесенные на MECM, созрели и стали структурно отличаться от той же партии hiPSC-CM, нанесенных на ECM мыши. Зрелые клетки приобретали палочковидную форму, в то время как незрелые сохраняли круглую форму.
Кардиомиоциты, окрашенные антителами альфа-актинина, показали типичную форму клеток, культивируемых при каждом состоянии ECM. В соответствии с окрашиванием TnI, окрашивание альфа-актинина указывало на то, что hiPSC-CM, созревшие на MECM, способствовали палочковидному зрелому фенотипу и индуцировали большую организацию саркомера. Содержание и активность митохондрий были различны между клетками, культивируемыми на ECM мыши и MECM.
Электрофизиологические данные о потенциалах действия, записанные с использованием VSD и системы оптического картирования, показали, что предсердные клетки имеют значительно более высокую частоту спонтанных ударов и более короткую продолжительность потенциала действия, или APD80, чем желудочково-специфические клетки. Тепловые карты всей пластины для таких параметров, как APD80, показали воспроизводимость заданного параметра в пластине. Типичные потенциалы действия зрелых монослоев hiPSC-CM указывают на морфологию потенциала действия выделенных и протестированных кардиомиоцитов взрослого человека.
Также был показан типичный спонтанный ритм потенциала действия. В ответ на изопротеренол активация бета-1-адренорецепторов вызывала положительную хронотропию, положительную инотропию и положительную лузитропию. Реакция HiPSC-CM на человеческий ген, связанный с Ether-a-go-go, или hERG, блокатор каналов, включая E-4031, домперидон, вандетаниб и соталол, была изучена с использованием флуоресценции кальция GCaMP6m для мониторинга ритма.
Исследование показало обнаружение ранних постдеполяризаций, вызванных блокадой канала Е-4031 hERG. Быстро работайте с клетками в суспензии и избегайте напряжения сдвига, аккуратно пипетируя клетки. Кроме того, выполняйте смену носителя осторожно, чтобы не повредить синцитию hiPS.
После этой процедуры клетки поддаются сбору белков, РНК, ДНК и липидов для анализа с помощью любимой техники исследователей. Этот метод позволяет исследователям исследовать заболевания и проверять кардиотоксичность новых лекарств с использованием взрослых кардиомиоцитов.
