Этот протокол для нарезки и культивирования секций сердечной ткани в течение шести дней в физиологических условиях, которые могут быть использованы для острого тестирования сердечной токсичности, а также тестирования эффективности терапии сердечной недостаточности. Эта культурная система может стать мощной прогностический человек на месте модели для острого сердечного тестирования токсичности, что закрывает разрыв между доклинических и клинических результатов тестирования. Демонстрацией процедур будет Цинхуэй Цюй, руководитель лаборатории из нашей лаборатории.
Чтобы получить кусочки свиной ткани сердца, сначала добавьте лед в тканевую ванну охлаждающую куртку виброма и добавьте в ванну раствор Тирода. Используйте одну литровую пластиковую банку для сбора расплавленного стока льда из охлаждающей куртки ванны ткани и перенесите свиное сердце в лоток, содержащий один литр свежего холодного кардиоплегического раствора в шкафу биобезопасности. Используйте втягиваемые стерильные скальпели, чтобы вскрыть сердце, чтобы изолировать левый желудочек и использовать прямоугольные лезвия бритвы, чтобы разрезать левый желудочек на один-два кубических сантиметра блоков.
Отложите один блок ткани для нарезки и поместите оставшиеся кусочки блока ткани в 50 миллилитровую трубку холодного раствора тирода на льду. Аккуратно массируйте зарезервированный блок ткани и добавьте одну-две капли ткани клея к держателю металлического образца вибромы. Придерживайтесь кусок 4%agar блок с площадью поверхности около одного квадратного сантиметра к клею и добавить от одной до двух капель ткани клея к агару.
Прикрепите блок сердца к стороне агара сердечного эпикардия вниз с тканью, как плоский против держателя, как это возможно, и место держателя ткани с блоком сердца в нарезке ванны вибромы. Очень важно, чтобы придерживаться блока сердца к агару с сердечной стороны эпикардия лицом вниз на ткани клея и убедиться, что ткань как можно более плоским. Затем прикрепите кислородную трубку к нарезной ванне и металлическому подносу, наполненному раствором Tyrode, и поместите 40 микрометровых клеточных ситечко на металлический лоток для сбора секций сердечной ткани по мере их нарезки.
Используйте программное обеспечение для работы с вибромой, чтобы регулировать высоту лезвия и образца так, чтобы лезвие было близко к верхней части ткани, но ниже папиллярных мышц и жидкости покрывало ткань и лезвие. Выберите заранее, чтобы настроить, где начать нарезки ткани. Нажмите ломтик, чтобы увеличить скорость и использовать ручку, чтобы переместить лезвие к краю ткани.
Нажмите ломтик снова, чтобы остановить и заранее, чтобы инактивировать процесс. Затем отрегулируйте параметры резки, как указано, и нажмите ломтик, чтобы начать нарезку ткани. Когда лезвие достигает конца ткани, но прежде чем он попадает в конец держателя образца, нажмите ломтик снова, чтобы остановить и нажмите вернуться, чтобы вернуться в положение старта.
Когда ломтики достигают полной длины и, как представляется, хорошего качества, используйте пластиковые пастер пипетки заполнены холодным раствором тирод мягко собирать ткани из ванны с помощью миппов и пружинных ножниц, чтобы вывихнуть ломтик из сердца по мере необходимости. Поместите каждый собранный кусочек в одноклеточный ситечко в оксигенированную ванну Tyrode и используйте раствор в пипетку, чтобы нажать ткань на поверхность ситечко клетки. Затем поместите металлическую шайбу на верхнюю часть ткани, чтобы удержать ее.
После по крайней мере один час в кислородом Tyrode раствор, обрезать за пределами каждого ломтика, чтобы удалить любые неравномерные края и клей конце каждого ломтика на шесть миллиметров широкий кусок стерилизованного полиуретана принтера сроки пояса со встроенными металлическими проводами. Поместите поддерживаемые ломтики сердца в шесть хорошо пластин, содержащих шесть миллилитров культуры среды на колодец и использовать стерильные типсы, чтобы убедиться, что ткань находится в центре хорошо. Позаботьтесь о том, чтобы крышка пластины не касалась ткани и не поместит пластину на культурную пластину так, чтобы изогнутая сторона крышки пластины совпадает с угловой стороной пластины и чтобы квадратные углы выстраивались.
Поместите ломтики в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа инкубатор. Замените супернатанты культуры шестью миллилитров свежей кислородной культуры среды три раза в день. Подключите крышку к электрическому стимулятору культуры клетки и отрегулируйте стимулятор для того чтобы непрерывно поставить 10 вольт электричества и частоту hertz 1.2 к ломтикам сердца.
После подключения к стимуляции, ломтики сердца начнут биться. Каждый день в течение полудня изменения средств массовой информации, заменить стимуляции пластины крышку из культуры блюдо, чтобы предотвратить выброс токсичных частиц графита в среде культуры. Вставьте белую вилку пены, где используемая крышка подключается к кабелю для электрического стимулятора культуры клеток, чтобы предотвратить повреждение воды электрической цепи и поместить крышку пластины в ванну с автоматической водой, дополненной 2X антибиотиком/антимикотикой.
На следующий день, обеззараживать крышку пластины в 70% этанола ванну в течение пяти до 15 минут, прежде чем передать крышку в свежей автоклавированной водяной бане, дополненной 2X антибиотик / антимикотик в течение трех минут. После полоскания крышки пластины, используйте этанол распыляется чистой ворсинки без салфетки, чтобы удалить остатки воды из пластиковых частей и удалить белую вилку пены. Затем крышка готова к размещению обратно в культурную тарелку.
Используя эту новую биомиметическую установку культуры, как попродемонстрировано, свиные ломтики сердца жизнеспособность была сохранена в течение шести дней, как оценивается MTT анализа. В первые шесть дней, подобно ответам, наблюдаемым для свежих ломтиков сердца, в кардиомиоцитах свиного сердца нет спонтанных преходящих кальция. Кардиомиоциты действительно реагировали на внешнюю электрическую и бета-адренергическую стимуляцию.
Кроме того, контрактильной силы и ответы на изопротеренол были сохранены в сердце ломтик культуры на срок до шести дней, аналогичные тем, которые наблюдаются в свежих ломтиков сердца. Несколько структурных и функциональных оценок могут быть выполнены на срезах сердца, включая анализ жизнеспособности МТТ, иммуностимулятор, электронную микроскопию, переходные измерения кальция, оценки контрактильной функции, метаболические оценки и анализ. В настоящее время мы используем эту культурную систему для проверки острой сердечной токсичности и эффективности препаратов и генной терапии, представляющих интерес для свиней и человеческих ломтиков сердца.
