Этот протокол описывает рабочий процесс для генерации, обслуживания и оптического анализа сердечных сфероидов. Эти сердечные сфероиды необходимы для заполнения пробела в современных моделях заболеваний in vitro. Этот метод позволяет исследователям создавать высокопроизводительный скрининг следующего поколения и функциональное хранение сердечных сфероидов.
Начните с добавления одного миллилитра на квадратный сантиметр стерильного раствора для отслойки сердца в каждую лунку культуральной пластины, содержащей сливающиеся индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток. Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Подтвердите отслоение клеток, наблюдая за белыми и круглыми клетками под 4-кратным увеличением яркопольного микроскопа.
Используя пятимиллилитровую пипетку, механически диссоциируйте клетки, промыв их двумя миллилитрами теплой базальной среды, чтобы приготовить одноклеточную суспензию. Перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугу в течение трех минут при 300 г. Затем аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в одном миллилитре среды для повторного покрытия hiPSC-CM.
Используйте наконечник пипетки объемом 1 000 микролитров, чтобы диссоциировать клеточную гранулу. После трех или четырех смешиваний, когда раствор станет однородным, загрузите его в кассету для подсчета ячеек и перенесите соответствующее количество ячеек в 100 микролитров реплагирующей среды в каждую лунку со сверхнизкой насадкой, круглодонную, 96-луночную пластину. Поместите пластину сердечных сфероидов на орбитальный шейкер в инкубаторе при 70 об/мин с температурой 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа, 21% кислорода и 90% влажности в течение 24 часов.
Чтобы избежать разрыва сфероида, аспирируйте только 50 микролитров среды из каждой лунки и добавляйте 100 микролитров RPMI плюс среду B27 на лунку в течение первых 48 часов. Затем аспирируйте 100 микролитров среды из каждой лунки и добавьте 100 микролитров среды для созревания в каждую лунку. Поддерживайте клетки в среде созревания и обновляйте среду каждые два-три дня.
Поместите сфероидальную пластину на лед на 10 минут для предварительного охлаждения, а затем центрифугируйте пластину в течение трех минут при 70 г. Удаляйте среду до тех пор, пока в лунке не останется 50 микролитров. Затем добавьте 200 микролитров ледяной морозильной среды hiPSC на лунку.
Запечатайте пластину пластинчато-герметизирующей пленкой. Чтобы приготовить кремниевую форму, смешайте компоненты набора кремниевого эластомера в соотношении 10 к 1 и добавьте раствор в нижнюю часть луночной пластины. Удаляйте пузырьки раствора с помощью вакуумного насоса в течение 15-20 минут.
Поместите форму в духовку и выдержите ее при температуре 60 градусов Цельсия в течение восьми часов, чтобы получить полугибкий эластомер, который снимается с пластины. Аккуратно поместите герметичную пластину в силиконовую форму, обеспечив равномерный теплообмен между колодезной пластиной и морозильной камерой. Заморозьте пластину при температуре 80 градусов по Цельсию в течение как минимум четырех часов в подготовленной силиконовой форме, прежде чем переложить пластину в резервуар с жидким азотом или морозильную камеру с температурой 150 градусов Цельсия для длительного хранения.
Чтобы обеспечить быстрое размораживание сердечных сфероидов, соберите по одной клеточной пластине с сердечными сфероидами за раз из жидкого азота и поместите ее в инкубатор на 15 минут при температуре 37 градусов по Цельсию, содержащей 5% углекислого газа, 21% кислорода и 90% влажности. Снимите герметизирующую пленку с пластины и аспирируйте 150 микролитров из каждой лунки, прежде чем добавить 200 микролитров теплой базальной среды в каждую лунку. Центрифугируйте тарелку на 70 г в течение трех минут и повторите теплую базальную среднюю промывку.
После этого удалите 150 микролитров среды и добавьте 200 микролитров размораживающей среды кардиомиоцитов в каждую лунку. Затем повторите промывку RPMI, как упоминалось во время генерации сердечного сфероида, с последующим поддержанием клеток в среде созревания. После одной недели культивирования размороженные сердечные сфероиды оптимальны для оптической визуализации кальция.
Аспирируйте по 150 микролитров каждой лунки. Обработайте размороженные сердечные сфероиды 100 микролитрами кальциевого красителя Cal-520 AM в каждой лунке в темноте и инкубируйте пластину в течение 60 минут. Подготовьте систему сбора и анализа кальция, включив микроскоп и убедившись, что включена опция контроля окружающей среды.
Отрегулируйте размеры диафрагмы камеры и кадрирования, чтобы свести к минимуму область фона. Чтобы измерить кальциевый сигнал, с помощью 488-нанометрового лазера установите контраст на черный фон с ярко-зеленым сигналом во время высвобождения кальция. Запишите видео с постоянным потоком от 2 до 10 пиков в течение 10 секунд.
Запишите 10-секундное видео и просканируйте 96-луночную пластину, сначала двигаясь влево, а затем зигзагообразно вниз, чтобы покрыть всю пластину. После получения переходных процессов кальция проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для анализа флуоресцентных следов. Сердечные сфероиды приобрели 3D-структуру к первому дню после посева, которую можно было культивировать до шести недель.
Большинство трехнедельных сердечных сфероидов экспрессировали регулярную организацию саркомера с альфа-актинином и тропонином Т. Высокие уровни альфа-актинина в нулевом и трехнедельном сердечных сфероидах указывали на постоянный и очень чистый клеточный состав во время культивирования. Повышенная экспрессия сердечных генов, десмосом и митохондрий наблюдалась у сфероидов, чем у hiPSC-CM, культивируемых в 2D в течение 90 дней. Процент поражения сердечных сфероидов был одинаковым в первые три недели после генерации и значительно снизился на шестой неделе из-за ухудшения сердечных сфероидов.
Частота биения была значительно снижена на третьей неделе по сравнению с и снизилась на шестой неделе в результате ухудшения. Переходные параметры кальция указывали на более высокое пиковое значение на второй неделе, в то время как время нарастания, время распада и продолжительность переходного процесса кальция при 90% распада были значительно увеличены на третьей неделе, показывая, что сфероиды, полученные из hiPSC-CM, были функционально оптимальны на второй и третьей неделях после генерации. Размер сфероида увеличивался с увеличением количества ячеек, используемых для посева.
В больших размерах, старых сфероидах, биение было значительно выше. Аналогичную и значительно более высокую скорость биения показали 5k, 10k и 20k сфероиды по сравнению с 2,5k сфероидами. Криоконсервация не влияла на жизнеспособность клеток в сердечных сфероидах.
Аналогичная экспрессия саркомерных белков в размороженных и свежих сфероидах, соответствующих возрасту, указывала на эффективность криоконсервации. Не было существенных изменений в скорости биения размороженных или свежих сердечных сфероидов. Существенных изменений не наблюдалось во времени нарастания, времени распада и CTD90 талых или свежих CS. Наряду с моделированием заболеваний и высокопроизводительным скринингом лекарств, эти сфероиды также могут быть использованы для биореакторов производства внеклеточных везикул и внеклеточной терапии, связанной с везикулами.
Кроме того, биобанкинг этих сфероидов может быть использован в качестве нового источника кардиомиоцитов для регенеративных стратегий. Накопленные данные свидетельствуют о том, что биобанки моделей стволовых клеток, полученных от пациентов, для лечения муковисцидоза, рака и сердечных сфероидов имеют большой потенциал для раскрытия молекулярных механизмов скрининга лекарств и персонализированной медицины.
