Производство генетически модифицированных мышей и анализ их фенотипа позволяет нам понять конкретные функции генов в деталях, in vivo. Многочисленные важные результаты были обнаружены с использованием генно-модифицированных моделей животных. Метод, который мы описываем здесь, позволяет длинной ДНК имплантировать стволовые клетки с приемлемой эффективностью без выбора лекарств.
Этот метод полезен не только для фундаментальных наук о жизни, но результаты также будут реализованы в прикладных науках, таких как медицинская наука и наука о животных. Демонстрировать процедуру будут д-р Тихиро Эмори, доцент, и д-р Манабу Одзава, адъюнкт-профессор из моей лаборатории. После приготовления эмбрионального фибробласта мыши приготовьте чашку для культивирования клеток, покрытую желатином, как описано в рукописи, и инкубируйте ее в течение двух часов во влажном инкубаторе.
Удалите желатиновый раствор, дважды вымойте посуду PBS и храните ее при комнатной температуре до использования. Разморозьте митотически инактивированный замороженный запас MEF с помощью водяной бани, закаленной при 37 градусах Цельсия в течение одной минуты. За день до посева ESC поместите MEF на 60-миллиметровую посуду, покрытую желатином.
Разморозьте замороженную трубку ESC, как показано ранее, и поместите один раз от 10 до пятого ESC на 60-миллиметровую тарелку, содержащую предварительно засеянный MEF. Затем добавьте четыре миллилитра питательной среды ESC и инкубируйте блюдо до тех пор, пока ESC не достигнет 50-70% конфюлюзии. После промывки культивируемого ESC четырьмя миллилитрами PBS переварите их 800 микролитрами 0,25%-трипсина раствора ЭДТА в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.
Как только трипсин инактивируется одним миллилитром ESCM, добавьте один миллилитр свежего ESCM к ячейкам, перенесите среду в трубку и гранулируйте ячейки центрифугированием при 280 G в течение пяти минут. После повторного использования клеток в одном миллилитре свежего ESCM подсчитайте концентрацию клеток с помощью счетчика клеток с окрашиванием трипан-синего цвета. После однократного переноса 10 на пятый ЭСК в новую 1,5-миллилитровую трубку и трижды промывки их PBS центрифугированием, повторно суспендируйте гранулу ESC в 12 микролитрах смеси ДНК Cas9 RNP и хорошо перемешайте путем мягкого пипетирования, чтобы избежать пузырьков.
Затем подавайте взвешенный ESC для электропорации. Затем культивируйте электропорированные ЭСК в 60-миллиметровой чашке, содержащей четыре миллилитра ECSM, с митотически инактивированным MEF и продолжайте ежедневно менять среду. Через три-пять дней после электропорации промыть ЭСК четырьмя миллилитрами PBS, затем переварить их с 800 микролитрами 0,25% трипсина ЭДТА и культивированием во влажном инкубаторе.
После этого добавьте два миллилитра ESCM, чтобы остановить переваривание трипсина. После того, как клеточная смесь гранулирована, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежего ESCM и подсчитайте концентрацию клеток с помощью счетчика клеток с окрашиванием трипана синим цветом. Пропускайте ЭСК в один раз по 10 в третью ячейку на 60-миллиметровую тарелку, содержащую ESCM и питатель MEF.
Убедитесь, что среда меняется до тех пор, пока колония не поднимется. Через пять-семь дней после первого прохождения, после того, как ESCM аспирируется из чашки для культуры ESC, добавьте четыре миллилитра PBS. Используя 20-микролитровую пипетку, подберите одиночные колонии ESC с пятью микролитрами PBS под стереомикроскопом.
Поместите отдельные колонии в лунку круглодонной 96-луночной пластины, содержащей 15 микролитров 0,25% раствора трипсина ЭДТА. После инкубации 96-луночной пластины прекратите переваривание трипсина путем добавления 80 микролитров ESCM и диссоциации колоний ESC в отдельные клетки путем пипетирования. Для генотипирования ПЦР перенесите 40 микролитров суспензии ЭКУ на пластину с желатиновым покрытием, без подачи, 96 скважин, содержащую 50 микролитров ESCM на скважину.
Чтобы получить замороженный запас ЭКУ, переложите оставшиеся 60 микролитров суспензии ЭКУ в колодец из 24 скважин с желатиновым покрытием, содержащий 500 микролитров ESCM и питатель MEF. Запасайте отдельные клоны ЭКУ, культивируемые в 24-луночной пластине, пока они не достигнут 60-80% слияния, и восстанавливайте отдельные клоны ЭКУ путем трипсинизации, как было продемонстрировано ранее. После получения ячейки гранулы методом центрифугирования повторно суспендируют в 500 микролитрах клеточной морозильной среды, чтобы заморозить клетки при минус 80 градусах Цельсия.
Для генотипирования ПЦР культивируйте клоны ЭКУ, как было продемонстрировано ранее, и удаляйте ESCM из каждой скважины путем аспирации перед промывкой ее 100 микролитрами PBS дважды. После аспирации PBS добавляют 100 микролитров лизисного буфера, содержащего протеиназу K, и хорошо перемешивают. Теперь перенесите лизат ESC в новую 1,5-миллилитровую трубку и держите его в тепловой камере при температуре 65 градусов Цельсия в течение не менее одного часа.
Как только геномная ДНК растворится в 20 микролитрах воды без ДНКазы, определите чистоту и концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. После выполнения геномной ПЦР с использованием локус-специфических наборов праймеров для усиления целевой области, проверьте последовательность и выберите клоны ESC с желаемыми последовательностями выбивания. После спаривания обработанных гормоном самок с самцами ICR и сбора яйцевода поместите собранные яйцеводы в капли FHM и восстановите двухклеточные или четырехклеточные эмбрионы стадии, промыв яйцевод FHM с помощью промывочной иглы, вставленной в инфундибулум.
Вымойте собранные эмбрионы, переместив их в несколько свежих капель FHM с помощью пипетки для рта. Культивируйте эмбрионы в 50 микролитрах капель KSOM на 35-миллиметровой чашке для культивирования клеток, покрытой минеральным маслом, как было показано ранее, в течение одного дня до достижения восьмиклеточной или моруловой стадии. Подготовьте стеклянные пипетки для удержания эмбрионов и инъекции ESC с помощью съемника и микроклепки.
После интеграции удерживающей пипетки, содержащей FHM, в капиллярный держатель, подключенный к микроинжектору, установите его на левой стороне микроманипулятора. Подключите инъекционную пипетку к другому микроинжектору и установите ее с правой стороны. Выровняйте две пипетки прямо в поле зрения микроскопа.
Сделайте пятимикролитровые капли 12%-го поливинилпирролидона и пятимикролитровые капли FHM на одну и ту же крышку 60-миллиметровой посуды, бок о бок. Залейте капли минеральным маслом. Перенесите эмбрионы в пять микролитров капли FHM и добавьте от одного до пяти микролитров суспензии ESC к капле FHM, содержащей эмбрион.
После того, как инъекционная пипетка промыта поливинилпирролидоном, переместите инъекционную пипетку к капле, содержащей эмбрионы и ЭСК. Выберите три отдельных дублета ESC, которые только что закончили свое деление клеток в инъекционной пипетке. Используя удерживающую пипетку, удерживайте восьмиклеточный или эмбрион стадии морулы, который завершил уплотнение путем аспирации, и сделайте отверстие в пеллюцидной зоне пьезоэлектрическим импульсом.
Изгоните шестиклеточный ЭКУ внутрь пеллюцидной зоны и вытащите пипетку из эмбрионов. Промыть эмбрионы, введенные ESC, несколькими каплями KSOM осторожно с помощью пипетки для рта и инкубировать их в новой 50-микролитровой капле KSOM, покрытой минеральным маслом, как показано ранее, пока эмбрионы не разовьются до стадии бластоцисты. Получен ампликон ПЦР размера, специфичного для мишени, и 9 из 22 клонов показали специфическую полосу.
Эти результаты эффективны и воспроизводимы для выбивания генов без какого-либо выбора лекарств. Подбор оптимального размера колоний ЭКУ весьма важен для этой процедуры. Избегайте выбора колоний, которые слишком большие или слишком маленькие.
CRISPR Cas9-опосредованное прямое редактирование генома с использованием зиготы будет применимо для создания простых мышей с нокаутом генов. Этот CRISPR Cas9-опосредованный протокол нацеливания гена ESC облегчает производство различных генетически модифицированных мышей для будущего анализа в области наук о жизни.
