Этот метод может проверять направляющие РНК у эмбрионов, тестировать вопросы раннего развития или создавать отредактированных мышей. Любые достижения в CRISPR Cas9 могут быть использованы с этим методом. Основным преимуществом этого метода является то, что он прост в освоении и использует реагенты, которые доступны лабораториям, имеющим доступ к мышам.
В будущем этот метод будет полезен для коррекции заболевания или мутации у потомства животного-компаньона или животного, важного для сельского хозяйства. Этот метод лучше всего подходит для создания моделей мыши. В нашей лаборатории мы использовали вариации этого метода для исследования событий, связанных с оплодотворением и ранним развитием преимплантации, в частности, регуляцией генов в потенции эмбриона.
Наиболее сложной частью является использование стеклянной иглы для перемещения эмбрионов с тарелки на тарелку. Продемонстрировать эту процедуру будет Шанталь Диалло, специалист по исследованиям в моей лаборатории. Чтобы начать сбор и обработку эмбрионов, поместите усыпленную самку мыши на спину и распылите 70% этанола на брюшную полость, чтобы ее можно было открыть хирургическим путем.
Чтобы открыть брюшную полость и удалить яйцеводы, срежьте слой кожи хирургическими ножницами и расположите яичники. Затем хирургически удаляют оба яйцевода, расположенные проксимально к яичникам, и помещают их в отдельные 50-микролитровые капли среды М2 плюс БСА. Под стереомикроскопом используйте рассеченные щипцы, чтобы проколоть ампулу яйцевода, чтобы освободить кучевые ооцитарные комплексы, или КОК, содержащие ооциты, затем, чтобы избежать переноса мусора, перенести и объединить каждый кучевой ооцит в одну 50-микролитровую каплю M2 плюс BSA с обработанной пипеткой, установленной на 20-30 микролитр.
Затем, чтобы удалить кучевые клетки из зигот, перенесите КОК с небольшим количеством дополнительной среды в каплю 100-микролитра M2 плюс гиалуронидазу и осторожно перемешайте путем пипетирования, пока эмбрионы не будут заметно отделены от гораздо меньших кучевых клеток. Чтобы разбавить гиалуронидазу и очистить рыхлые кучевые клетки, используйте пипетку, управляемую ртом, чтобы переместить зиготы в свежий 50-микролитр M2 плюс каплю BSA. Далее, чтобы размыть пеллюцидную зону эмбриона и уменьшить дополнительные физические препятствия для доставки реагента, перенесите эмбрионы в предварительно расплавленную 100-микролитровую каплю кислоты Тирода, или раствор АТ, на 60-миллиметровой пластине.
Непрерывно наблюдают за зиготами под стереомикроскопом до тех пор, пока не будет размыто 30% пеллюцидной зоны, затем, чтобы разбавить АТ, пропустят эмбрионы через четыре 50-микролитровые капли М2 плюс БСА. Затем определите соответствующее количество эмбрионов, которые были обработаны, подсчитав их под стереомикроскопом. Разбавляют BSA, пропуская эмбрионы через две капли по 50 микролитров восстановленной сывороточной среды.
Затем ротовая пипетка от 25 до 30 эмбрионов в 10-микролитровую каплю восстановленной сывороточной среды, затем используйте ручную пипетку, чтобы добавить 10 микролитров рибонуклеопротеина или комплекса RNP. Разбавьте вязкий глицерин из комплекса RNP и гомогенизируйте образец путем пипетки 10 раз или до тех пор, пока смесь больше не покажет вязкость. Далее пипетку 20 микролитров смеси эмбриона и RNP в 0,1-сантиметровую электропорационную кювету, избегая пузырьков, затем для доставки редактирующих реагентов в зиготу, электропорируют эмбрионы с использованием протокола квадратной волны 30 вольт, от 4 до 6 импульсов с длиной импульса 3 миллисекунды и интервалами импульсов 100.
Затем добавьте 50 микролитров M2 плюс BSA в верхнюю часть кюветы, чтобы смыть эмбрионы из кюветы и аккуратно выложить эту смесь на тарелку. Для культивирования эмбрионов перенесите от 20 до 30 зигот в капельку KSOM плюс BSA в предварительно уравновешенной культуральной пластине и переместите эмбрионы в каплю. Инкубируйте пластину в течение ночи при 37 градусах Цельсия в 5% углекислого газа с влажностью 95%.
На следующий день перенесите только двухклеточные эмбрионы в свежую каплю смеси KSOM плюс BSA и верните пластинку в инкубатор. Оставьте или выбросьте мертвые или неоплодотворенные эмбрионы. Перед генотипированием промывайте эмбрионы бластоцисты морулы двумя каплями DPBS, чтобы разбавить компоненты среды, которые могут мешать реакции ПЦР.
Используя ротовую пипетку, перенесите отдельные эмбрионы в одну лунку 8-луночной полосы ПЦР и добавьте 10 микролитров буфера лизиса. Далее, чтобы лизировать эмбрионы, запрограммируйте тепловой циклер до 55 градусов Цельсия в течение 4 часов, затем инактивируйте протеиназу К с помощью 10-минутной инкубации при 95 градусах Цельсия. В этом исследовании показан пример стратегии нацеливания на локус тирозиназы мыши в качестве положительного контроля, включая конструкции олиго и стратегии генотипирования для негомологичного соединения концов и направленного восстановления гомологии.
При доставке одной одноповодной или sgRNA доставка RNP составляла до 100% включительно в черных штаммах мышей C57 6J и C57 black 6N с образованием экстрасивных делеций, происходящих при 50-100%, и небольших заменителей на основе олиго в диапазоне от 17 до 63% При разработке геномных делеций эффективность редактирования варьируется от 3% до 100% Эмбрион должен содержаться в как можно более близких к идеальным условиям, чтобы быстрее протокол сделан, чем лучше. Кроме того, минимизируйте воздействие гиалуронидазы и кислоты Тирода. Этот метод описывает генерацию отредактированного животного, тестирование имплантации или гестационной жизнеспособности или выполнение эксперимента несколько раз для сбора измерений или изображений и различных показателей во время развития перед плантацией.
