Этот метод позволяет пользователям легко отслеживать Т-клетки in vivo, оценивать кинетику самонаведения и контролировать персистенцию Т-клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно повторять в несколько моментов времени на одном и том же животном, не требуя жертв при проточной цитометрии или иммуногистохимии. Этот метод может быть модифицирован для отслеживания других типов иммунных клеток.
Чтобы культивировать 293Т-клетки, приготовьте один литр DMEM, добавив 110 миллилитров инактивированной теплом эмбриональной бычьей сыворотки и 11 миллилитров пенициллина стрептомицина. Разморозьте пять раз по 10 до шестой ячейки 293T и перенесите их в колбу T175, содержащую DMEM. Разделяйте клетки от одного до 10 каждые три дня в течение шести дней, прежде чем клетки станут более чем на 90% сливающимися.
Для трансфекции перенесите 1,5 миллилитра среды в две 50-миллилитровые пробирки с помощью пипетки. В одну пробирку добавьте 10 мкг плазмиды VSVG, 20 мкг gag pol и 20 мкг плазмиды люциферазы красного TDtomato или CBRTDR и перемешайте. Добавьте 100 микролитров реагента для трансфекции ДНК in vitro в другую пробирку и перемешайте.
Инкубируйте обе пробирки при комнатной температуре в течение пяти минут. Перенесите среду, содержащую реагент для трансфекции ДНК in vitro, по каплям в пробирку, содержащую плазмиды ДНК, и аккуратно перемешайте пипеткой. Выдерживать при комнатной температуре 20 минут.
Во время инкубации отделите клетки 293T, добавив от пяти до 10 миллилитров 0,05% трипсина. После того, как клетки отсоединились, добавьте 10 миллилитров среды и центрифугу при 800 G в течение пяти минут. Ресуспендируют клетки в 1,5 миллилитрах среды.
Добавьте среду, содержащую реагент для трансфекции ДНК in vitro, и плазмиды ДНК в клетки 293T и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации переложите суспензию в колбу Т175. Добавьте 18 миллилитров среды и выдержите при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.
На следующий день осторожно аспирируйте носитель стеклянной пипеткой, не отрывая клеток, и замените его 18 миллилитрами свежего носителя. Опять же, инкубируйте ночь при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день удалите вирусную надосадочную жидкость с помощью пипетки, помещенной на лед, и центрифугируйте при 800 г в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки и мусор.
Отфильтруйте вирусную надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,22 микрона и сразу же поместите ее на лед. Для активации in vitro Т-клеток человека добавьте 10 миллилитров PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина или BSA, и два миллимоляра ЭДТА в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Затем, чтобы промыть бусины, добавьте бусины в тюбик и поместите тюбик в магнитную стойку.
Через две минуты извлеките PBS из трубки. После приготовления DMEM добавьте промытые шарики и интерлейкин-2 или IL-2 до конечной концентрации 30 международных единиц на миллилитр. Подсчитайте Т-клетки с помощью гемоцитометра и окрашивания трипановым синим.
После подсчета добавьте желаемое количество Т-клеток в среду и аккуратно переверните пробирку для перемешивания. Планшет 2,5 миллилитра среды, содержащей два миллиона Т-клеток, шариков и IL-2 в каждой лунке 24-луночной пластины для культивирования тканей. Культура при 37 градусах Цельсия в увлажненном 5%-ном углекислом газе.
Исследуйте Т-клетки под 20-кратным объективом каждый день в течение трех дней, чтобы определить, когда проводить трансдукцию люциферазой. Затем, чтобы приготовить пластину RetroNectin, добавьте два миллилитра по 20 микрограммов на миллилитр RetroNectin in PBS в лунку необработанной шестилуночной пластины и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре. Аспирируйте RetroNectin, не царапая дно пластины, и добавьте три миллилитра 2% BSA в PBS на лунку в шестилуночную пластину.
Выдерживать 30 минут при комнатной температуре. Затем для спинокуляции аспирируйте BSA и один раз промойте лунки тремя миллилитрами PBS. Продолжите или замените свежим PBS и оставьте тарелку покрытой при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.
На следующий день добавьте два миллилитра надосадочной жидкости CBRTDR люциферазы на лунку и центрифугу в дозе 1 240 г в течение 90 минут при 32 градусах Цельсия. Для трансдукции, после подсчета Т-клеток, аспирируют вирусную надосадочную жидкость и помещают два миллиона Т-клеток в лунку в шесть миллилитров DMEM, содержащих 30 международных единиц на миллилитр человеческого IL-2. Исследуйте Т-клетки в течение двух дней.
Когда ячейки почти сливаются, аккуратно смойте их со дна тарелки с помощью пипетки и переложите каждую лунку в отдельную колбу T75. Добавьте девять миллилитров среды, чтобы получить общий объем 15 миллилитров на колбу. На следующий день добавьте 15 миллилитров среды и подтвердите успешную трансдукцию, выполнив проточную цитометрию.
После анестезии мыши с помощью иглы 26 калибра ретроорбитально вводят 20 миллионов Т-клеток в 100 микролитров среды. Подкожно вводят 1 000 единиц рекомбинантного IL-2 для поддержки выживания Т-клеток in vivo. Затем вводят биспецифическое антитело ретроорбитально или внутрибрюшинно.
Для визуализации in vivo вводят 100 микролитров трех миллиграммов D-люциферина путем ретроорбитальной инъекции иглой 26 калибра анестезированной мыши. Для захвата изображений поместите мышь в светонепроницаемую камеру тепловизора так, чтобы бок, несущий ксенотрансплантат, был обращен вверх к камере. С помощью панели управления сбором данных выберите люминесцентный, фотографический и наложенный.
Установите время экспозиции на «Авто», биннинг на «Средний» и диафрагму на единицу и получайте изображения. После первого изображения установите время экспозиции, соответствующее времени, автоматически рассчитанному для первого изображения, чтобы можно было напрямую сравнивать последующие изображения. Сделайте еще один набор снимков с мышью на спине, чтобы оценить присутствие Т-клеток в легких.
Вооруженные Т-клетки доставлялись в опухоль быстрее, чем невооруженные Т-клетки, покидая легкие на два дня раньше. Количественное определение инфильтрации Т-клеток в опухоли с течением времени измерялось с помощью биолюминесценции и выражалось в виде общего количества флок или сияния на пиксель, интегрированный по контуру опухоли. Трафик Т-клеток можно контролировать в течение 28 дней после инъекции Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, что позволяет отслеживать самонахождение и персистенцию Т-клеток на протяжении всего лечения.
Показана транспортировка Т-клеток в HER2-положительные ксенотрансплантаты, полученные из пациентов с раком молочной железы человека, у мышей DKO. Лечение биспецифическим антителом HER2 с немолчаливым FC не влияло на рост опухоли по сравнению с контролируемым биспецифическим антителом. Напротив, лечение биспецифическим антителом HER2, содержащим мутацию N297A, отдельно или в сочетании с мутацией K322A, смогло полностью остановить рост опухоли.
Для групп с сайленсирующими мутациями сигнал люминесценции Т-клеток достиг более высокого пика на третий день после инъекции и сохранялся на более высоком уровне по сравнению с контролируемым биспецифическим антителом и немолчаливым биспецифическим антителом HER2. Мыши, несущие ксенотрансплантаты, полученные от пациентов с нейробластомой, продемонстрировали, что истощение Ly6C-положительных макрофагов значительно увеличило самонахождение Т-клеток в опухолях, что привело к снижению роста опухоли и увеличению выживаемости. Эффект был более выражен при ксенотрансплантатах, полученных пациентами с остеосаркомой.
Среди биспецифических антител, нацеленных на опухолевый антиген STEAP1, формат IGGL SCFV приводил к значительно большей инфильтрации Т-клеток на шестой день после первой дозы Т-клеток, которая сохранялась в течение всего периода лечения. Такие наблюдения не были предсказаны анализами цитотоксичности in vitro. После отслеживания Т-клеток in vivo пользователи все еще могут выполнять иммуногистохимию, чтобы более точно определить, где Т-клетки расположены в опухоли или других нормальных тканях.
