この方法により、ユーザーはin vivoでT細胞を簡単に追跡して、ホーミングの速度論を評価し、T細胞の持続性を監視できます。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学において犠牲を必要とせずに、同じ動物上の複数の時点で繰り返すことができることである。この手法は、他の種類の免疫細胞を追跡するためにも変更できます。
293T細胞を培養するには、110ミリリットルの熱不活化ウシ胎児血清と11ミリリットルのペニシリンストレプトマイシンを添加して1リットルのDMEMを調製します。6番目の293T細胞に10回5回解凍し、DMEMを含むT175フラスコに移します。細胞が90%以上コンフルエントになる前に、6日間、3日ごとに細胞を1〜10に分割します。
トランスフェクションの場合は、ピペットを使用して1.5ミリリットルの培地を2本の50ミリリットルチューブに移します。1本のチューブに、10マイクログラムのVSVGプラスミド、20マイクログラムのギャグポール、および20マイクログラムのカブトムシレッドTDトマトまたはCBRTDRルシフェラーゼプラスミドを加えて混合します。100 マイクロリットルの DNA in vitro トランスフェクション試薬を別のチューブに添加して混合します。
両方のチューブを室温で5分間インキュベートします。DNA in vitroトランスフェクション試薬を含む培地をDNAプラスミドを含むチューブに滴下し、ピペットで穏やかに混合します。室温で20分間インキュベートします。
インキュベーション中に、5〜10ミリリットルの0.05%トリプシンを加えて293T細胞を剥離します。細胞が剥離したら、10ミリリットルの培地を加え、800 Gで5分間遠心分離します。細胞を1.5ミリリットルの培地に再懸濁する。
DNA in vitroトランスフェクション試薬と DNA プラスミドを含む培地を 293T 細胞に加え、摂氏 37 度で 30 分間インキュベートします。インキュベーション後、懸濁液をT175フラスコに移します。18ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、細胞を剥離せずにガラスピペットで培地を注意深く吸引し、18ミリリットルの新鮮な培地と交換します。繰り返しますが、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、氷上に置いたピペットを用いてウイルス上清を除去し、800Gで5分間遠心分離して細胞および破片をペレット化した。
0.22ミクロンのフィルターを使用してウイルス上清をろ過し、すぐに氷の上に置きます。ヒトT細胞のin vitro活性化のために、0.1%ウシ血清アルブミンまたはBSAと2ミリモルEDTAを含む10ミリリットルのPBSを滅菌15ミリリットルのチューブに加えます。次に、ビーズを洗浄するには、ビーズをチューブに追加し、チューブを磁気ラックに置きます。
2分後、PBSをチューブから取り出します。DMEMを調製した後、洗浄ビーズとインターロイキン-2またはIL-2を最終濃度30国際単位/ミリリットルになるまで加えます。ヘモサイトメーターとトリパンブルー染色剤を用いてT細胞を計数します。
カウント後、必要な数のT細胞を培地に加え、チューブを静かに反転させて混合します。200万個のT細胞、ビーズ、およびIL-2を含む2.5ミリリットルの培地を24ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレートします。加湿した5%二酸化炭素中で摂氏37度で培養する。
20倍の対物レンズでT細胞を3日間毎日調べて、ルシフェラーゼで形質導入するタイミングを決定します。次に、レトロネクチンプレートを作製し、PBS中のレトロネクチン1ミリリットル当たり20マイクログラムの2ミリリットルを未処理の6ウェルプレートのウェルに加え、室温で2時間インキュベートする。プレートの底を傷つけずにレトロネクチンを吸引し、6ウェルプレートにウェルあたりPBSで3ミリリットルの2%BSAを追加します。
室温で30分間インキュベートします。次に、脊髄膜形成のために、BSAを吸引し、3ミリリットルのPBSでウェルを1回洗浄します。続行するか、新しいPBSと交換し、プレートを摂氏4度で一晩覆ったままにします。
翌日、ウェルあたり2ミリリットルのCBRTDRルシフェラーゼウイルス上清を加え、1, 240 Gで32°Cで90分間遠心分離します。形質導入のために、T細胞を計数した後、ウイルス上清を吸引し、1ミリリットル当たり30国際単位のヒトIL-2を含む6ミリリットルのDMEM中にウェル当たり200万個のT細胞をプレートする。T細胞を2日間調べます。
細胞がほぼコンフルエントになったら、ピペットを使用してプレートの底から細胞を静かに洗い流し、各ウェルを別々のT75フラスコに移します。9ミリリットルの培地を追加して、フラスコあたり合計15ミリリットルの容量にします。翌日、15ミリリットルの培地を加え、フローサイトメトリーを実施して形質導入が成功したことを確認します。
マウスに麻酔をかけた後、26ゲージの針を用いて、眼窩後方向に100マイクロリットルの培地中に2000万個のT細胞を注入する。in vivoでのT細胞の生存をサポートするために、1, 000単位の組換えIL-2を皮下投与する。次いで二重特異性抗体を眼窩後または腹腔内に投与する。
in vivoイメージングでは、麻酔をかけたマウスに26ゲージの針で眼窩後注射により、100マイクロリットルの3ミリグラムのD-ルシフェリンを投与します。画像をキャプチャするには、異種移植片を支える側面がカメラに向かって上を向くように、イメージャーの光密チャンバーにマウスを置きます。取り込みコントロールパネルを使用して、発光、写真、オーバーレイを選択します。
露光時間をオート、ビニングを中、Fストップを1に設定して画像を取得します。最初の画像の後、最初の画像に対して自動的に計算された露出時間と一致するように露出時間を設定して、後続の画像を直接比較できるようにします。マウス仰臥位で別の画像を撮影して、肺におけるT細胞の存在を評価します。
武装T細胞は非武装T細胞よりも早く腫瘍に輸送され、2日早く肺を離れました。経時的な腫瘍へのT細胞浸潤の定量は、生物発光によって測定され、腫瘍輪郭にわたって積分されたピクセルあたりの総フロックまたは放射輝度として表されました。T細胞輸送は、ルシフェラーゼ形質導入T細胞の注射後28日間モニターすることができ、治療中のT細胞のホーミングと持続性を追跡することができます。
DKOマウスにおけるHER2陽性ヒト乳癌患者由来異種移植片へのT細胞輸送が示されている。無サイレンシングFCによるHER2二重特異性抗体による治療は、対照された二重特異性抗体と比較して腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった。対照的に、N297A変異のみを含むHER2二重特異性抗体による治療、またはK322A変異との併用は、腫瘍の成長を完全に停止させることができました。
サイレンシング変異を有するグループの場合、T細胞発光シグナルは注射後3日目により高いピークに達し、対照二重特異性抗体および無消音HER2二重特異性抗体と比較してより高いレベルで持続した。神経芽細胞腫患者由来の異種移植片を有するマウスは、Ly6C陽性マクロファージの枯渇を示し、腫瘍へのT細胞ホーミングを有意に増加させ、腫瘍増殖の減少および生存期間の延長をもたらした。この効果は、骨肉腫患者由来の異種移植片でより顕著でした。
腫瘍抗原STEAP1を標的とする二重特異性抗体の中で、IGGL SCFVフォーマットは、治療期間中持続したT細胞の初回投与後6日目に有意に多くのT細胞浸潤をもたらしました。このような観察は、インビトロ細胞毒性アッセイによって予測されなかった。in vivoでT細胞を追跡した後でも、ユーザーは免疫組織化学を実行して、T細胞が腫瘍または他の正常組織内のどこにあるかをより具体的に特定できます。
