이 방법을 통해 사용자는 생체 내에서 T 세포를 쉽게 추적하여 귀환 동역학을 평가하고 T 세포 지속성을 모니터링할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석이나 면역조직화학에서 희생할 필요 없이 동일한 동물에서 여러 시점에서 반복될 수 있다는 것입니다. 이 기술은 다른 유형의 면역 세포도 추적하기 위해 수정될 수 있습니다.
293T 세포를 배양하기 위해, 110 밀리리터의 열-불활성화 태아 소 혈청 및 11 밀리리터의 페니실린 스트렙토마이신을 첨가하여 1 리터의 DMEM을 준비한다. 6번째 293T 세포를 10회 5회 해동하고 DMEM이 포함된 T175 플라스크에 옮깁니다. 세포가 90% 이상 융합되기 전에 6일 동안 3일마다 세포를 1-10개로 분할합니다.
트랜스펙션의 경우 피펫을 사용하여 1.5 밀리리터의 배지를 두 개의 50 밀리리터 튜브에 옮깁니다. 하나의 튜브에 10 마이크로그램의 VSVG 플라스미드, 20 마이크로그램의 개그 폴, 20 마이크로그램의 클릭 딱정벌레 레드 TDtomato 또는 CBRTDR 루시페라아제 플라스미드를 첨가하고 혼합합니다. 100 마이크로리터의 DNA in vitro transfection 시약을 다른 튜브에 첨가하고 혼합한다.
두 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 시험관내 형질주입 시약을 함유하는 배지를 DNA 플라스미드가 들어 있는 튜브에 적하하고 피펫으로 부드럽게 혼합한다. 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
배양 중에 0.05% 트립신 5-10밀리리터를 첨가하여 293T 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 10 밀리리터의 배지를 추가하고 800G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 1.5 밀리리터의 배지에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
DNA 시험관내 형질주입 시약 및 DNA 플라스미드를 함유하는 배지를 293T 세포에 첨가하고, 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 배양 후, 현탁액을 T175 플라스크로 옮긴다. 18 밀리리터의 배지를 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.
다음날, 세포를 분리하지 않고 유리 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인하고 18 밀리리터의 신선한 배지로 교체하십시오. 다시 말하지만, 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 얼음 위에 놓은 피펫을 이용하여 바이러스 상층액을 제거하고 800G에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 파편을 펠릿화하였다.
0.22 미크론 필터를 사용하여 바이러스 상청액을 여과하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 인간 T 세포의 시험관 내 활성화를 위해, 0.1% 소 혈청 알부민 또는 BSA 및 2밀리몰 EDTA를 함유하는 PBS 10밀리리터를 멸균된 15밀리리터 튜브에 첨가한다. 그런 다음 구슬을 씻으려면 구슬을 튜브에 넣고 튜브를 마그네틱 랙에 넣습니다.
2분 후, 튜브로부터 PBS를 제거한다. DMEM을 준비한 후, 세척 된 비드와 인터루킨 -2 또는 IL-2를 밀리리터 당 30 국제 단위의 최종 농도로 첨가한다. T 세포를 헤모세포분석기 및 트리판 블루 염색을 이용하여 계수하였다.
계수 후 원하는 수의 T 세포를 배지에 추가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 200만 개의 T 세포, 비드 및 IL-2를 함유하는 배지 2.5밀리리터를 플레이트에 넣었다. 섭씨 37도에서 가습 된 5 % 이산화탄소에서 배양하십시오.
루시페라아제로 형질도입할 시기를 결정하기 위해 3일 동안 매일 20X 대물렌즈 하의 T 세포를 검사합니다. 다음으로, RetroNectin 플레이트를 준비하기 위해, PBS 중의 20 마이크로그램 RetroNectin 2밀리리터를 처리되지 않은 6웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 플레이트 바닥을 긁지 않고 RetroNectin을 흡인하고 6웰 플레이트에 웰당 PBS에 2% BSA 3밀리리터를 추가합니다.
실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 다음으로, spinoculation을 위해, BSA를 흡인하고 PBS의 3 밀리리터로 우물을 한 번 세척한다. 계속하거나 새 PBS로 교체하고 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 덮어 둡니다.
다음날, 웰 당 2 밀리리터의 CBRTDR 루시페라아제 바이러스 상청액을 첨가하고, 섭씨 32도에서 90 분 동안 1, 240 G에서 원심 분리한다. 형질도입을 위해, T 세포를 계수한 후, 바이러스 상청액을 흡인하고, 인간 IL-2의 밀리리터당 30개의 국제 단위를 함유하는 DMEM의 6밀리리터에서 웰 당 200만 개의 T 세포를 플레이트한다. 이틀 동안 T 세포를 검사한다.
세포가 거의 융합되면 피펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 부드럽게 씻어내고 각 웰을 별도의 T75 플라스크로 옮깁니다. 플라스크당 총 15밀리리터 부피의 배지 9밀리리터를 추가합니다. 다음날 15 밀리리터의 배지를 추가하고 유세포 분석을 수행하여 성공적인 형질 도입을 확인합니다.
마우스를 마취한 후, 26 게이지 바늘을 사용하여, 2,000만 개의 T 세포를 100 마이크로리터의 배지에 후안와적으로 주입한다. 생체 내에서 T 세포 생존을 지원하기 위해 1, 000 단위의 재조합 IL-2를 피하 투여한다. 그런 다음 이중특이적 항체를 후안와내 또는 복강내로 투여합니다.
생체 내 이미징을 위해 마취된 마우스에 26게이지 바늘로 안와후 주사하여 3밀리그램의 D-루시페린 100마이크로리터를 투여합니다. 이미지를 캡처하려면 이종이식 베어링이 있는 측면이 카메라를 향하도록 이미저의 빛이 새지 않는 챔버에 마우스를 놓습니다. 획득 제어판을 사용하여 발광, 사진 및 오버레이를 선택합니다.
노출 시간을 자동으로, 비닝을 중간으로, f-스톱을 1로 설정하여 이미지를 획득합니다. 첫 번째 이미지 이후에는 첫 번째 이미지에 대해 자동으로 계산된 노출 시간과 일치하도록 설정하여 후속 이미지를 직접 비교할 수 있습니다. 폐에서 T 세포 존재를 평가하기 위해 마우스 앙와위로 또 다른 이미지 세트를 촬영합니다.
무장한 T 세포는 비무장 T 세포보다 더 빨리 종양으로 이동하여 이틀 더 빨리 폐를 떠났습니다. 시간 경과에 따른 종양 내로의 T 세포 침윤의 정량화는 생물발광에 의해 측정되었고, 종양 윤곽에 걸쳐 통합된 픽셀당 총 무리 또는 광도로서 표현되었다. T 세포 트래피킹은 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 주입 후 28일 동안 모니터링될 수 있었고, 치료 전반에 걸쳐 T 세포 귀환 및 지속성을 추적할 수 있었다.
DKO 마우스에서 HER2 양성 인간 유방암 환자 유래 이종이식편으로의 T 세포 트래피킹이 도시되어 있다. 침묵되지 않은 FC를 사용한 HER2 이중특이적 항체에 의한 처리는 대조된 이중특이적 항체에 비해 종양 성장에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, N297A 돌연변이를 단독으로 또는 K322A 돌연변이와 조합하여 포함하는 HER2 이중특이성 항체로 처리하면 종양 성장을 완전히 정지시킬 수 있었습니다.
침묵 돌연변이가 있는 그룹의 경우, T 세포 발광 신호는 주사 후 3일째에 더 높은 피크에 도달했고, 대조된 이중특이적 항체 및 침묵되지 않은 HER2 이중특이적 항체와 비교하여 더 높은 수준으로 지속되었습니다. 신경모세포종 환자 유래 이종이식편을 보유한 마우스는 Ly6C 양성 대식세포의 고갈이 종양에 대한 T 세포 귀환을 유의하게 증가시켜 종양 성장을 감소시키고 생존을 연장하는 것으로 나타났습니다. 그 효과는 골육종 환자 유래 이종이식편에서 더 두드러졌다.
종양 항원 STEAP1을 표적으로 하는 이중특이적 항체 중에서, IGGL SCFV 형식은 치료 기간 동안 지속되는 T 세포의 첫 번째 투여 후 6일째에 유의하게 더 많은 T 세포 침윤을 초래했습니다. 이러한 관찰은 시험관내 세포독성 분석에 의해 예측되지 않았다. 생체 내에서 T 세포를 추적한 후에도 사용자는 면역조직화학을 수행하여 T 세포가 종양 또는 기타 정상 조직 내에서 어디에 위치하는지 보다 구체적으로 결정할 수 있습니다.
