Поскольку в настоящее время исследуется множество инновационных методов лечения хронической боли, наш протокол предоставляет важные концепции для стандартизации операций, необходимых для вызывания нейропатической боли. Частичная перевязка седалищного нерва, или PSNL, является выгодной моделью для изучения нейропатической боли, поскольку она воспроизводит многие симптомы, наблюдаемые у людей с нейропатической болью. Поскольку PSNL воспроизводит многие симптомы, наблюдаемые у людей с нейропатической болью, этот протокол предоставляет важные концепции для изучения и разработки новых методов лечения боли.
Продемонстрацией процедуры будет Кевин Ченг, кандидат медицинских наук в моей лаборатории. Для начала приучайте мышей к испытательному аппарату фон Фрея в течение одного часа перед тестированием, поместив их в прозрачные коробки из плексигласа на проволочной сетке в той же комнате, что и испытательная комната. Нанесите серию калиброванных тонких мононитей перпендикулярно на поверхность сеялки ипсилатеральной задней лапы PSNL животных, содержащихся в подвешенных клетках из проволочной сетки.
Определите порог вывода, последовательно увеличивая или уменьшая силу стимула, соответствующую размеру нити. Увеличьте размер нити, когда реакция отрицательная, и уменьшите размер нити, когда животное убирает лапу. Сообщите об отрицательных и положительных ответах в техническом описании и протестируйте одну и ту же лапу четыре раза с разными нитями после первого положительного ответа.
Приучайте мышей к испытательному аппарату Харгривза в течение одного часа перед тестированием, поместив их в прозрачные коробки из плексигласа в той же комнате, что и комната для тестирования. Установите базовую задержку вывода лап с помощью аппарата Харгривза. Сфокусируйте источник лучистого тепла на поверхности сеялки задней лапы, ипсилатеральной по отношению к PSNL, и начните стимуляцию.
Когда животное уберет лапу, подождите, пока детектор движения остановит стимул и остановит таймер. Отрегулируйте интенсивность источника тепла, чтобы получить базовую задержку отрыва лапы примерно в 10 секунд. Затем запишите время вывода в таблицу.
Установите конфорку на 52 градуса Цельсия. Поместите животное в испытательную камеру и запустите хронометр. Наблюдайте за ноцифенсивным поведением и остановите хронометр, как только будет замечено ноцифенсивное поведение.
Затем извлеките животное из камеры и запишите задержку этого поведения. Обязательно очистите аппарат от мочи между каждым тестируемым животным, чтобы не повлиять на температуру теплового стимула. Очистите испытательную камеру 70% этанолом между животными, чтобы уменьшить поведенческое воздействие запахов.
Чтобы сделать нервный стеклянный крючок, включите конфорку бунзена. Держите один конец стеклянного стержня к огню в одной руке. Когда этот стеклянный стержень плавится, используйте другой стеклянный стержень в другой руке, чтобы направлять и тянуть плавящееся стекло на первом стержне.
Снимите первый стеклянный стержень с огня и дайте концу расплавленной части естественным образом скатиться внутрь, образуя небольшую форму шара с помощью второго стеклянного стержня. Зажмите пинцетом пальцы на задней лапе, чтобы убедиться в отсутствии лапного рефлекса, и проверьте рефлекс моргания роговицы перед нанесением смазывающей офтальмологической мази. Выбрав, с какой стороны проводить операцию, сформируйте заднюю ногу животного вокруг области бедра, снизу к коленной чашечке, сверху к бедру и над бедренной костью.
Далее трижды протрите хлоргексидином в одном направлении тремя отдельными марлями, чередующимися с теплым стерильным физиологическим раствором. Затем просуньте ногу через щель, сделанную в стерильной драпировке размером 10 на 10 сантиметров, чтобы создать стерильное поле вокруг выбранной ноги. С помощью тонких хирургических ножниц сделайте небольшой двухмиллиметровый разрез кожи по средней линии боковой стороны бедра.
Проведите ножницами под кожу круговыми движениями, чтобы пробить фасцию и создать зазор, увеличив пространство разреза. Затем с помощью вязных щипцов создают острый разрез глубиной один сантиметр по вертикали под углом 90 градусов в мышцах бедра. Затем вставьте тонкие маленькие ножницы в тот же разрез также под углом 90 градусов и осторожно раздвиньте их, чтобы разделить мышцы, пока не будет визуализирован седалищный нерв.
Найдите седалищный нерв, идущий параллельно вертикальному бедру по направлению от бедра к колену. Прежде чем продолжить, извлеките ножницы в вязыряющих щипцах из тела. Используйте очень тонкие щипцы в стеклянном крючке нерва, чтобы изолировать нерв снизу.
Осторожно освободите нервы от окружающих соединительных тканей в месте рядом с вертелом бедренной кости, который находится ближе всего к бедру и наиболее удален от колена. Дайте нерву отдохнуть на стеклянном стержне и убедитесь, что конец стержня предотвращает скатывание нерва. Поместите хирургический узел, чтобы связать одну треть ширины седалищного нерва, используя нейлоновый шов с девятью нулями, прежде чем он разделится на общую малоберцовую, большеберцовую и икроножную ветви.
Осторожно снимите нерв со стеклянного стержня, как только узел будет завершен, и заправьте его обратно в исходное место на уровне ниже отделенных мышц. Затем зашите разрез мышцы с помощью рассасывающегося полигликолевого шва с пятью нулями. Отдельно зашивают кожу с помощью нерассасывающегося полипропиленового шва с шестью нулями.
Затем запишите время окончания операции и анестезии. Дайте мыши проснуться в одиночестве в клетке для восстановления, прежде чем возвращать ее в новую чистую клетку. Используйте тест фон Фрея, Харгривза или горячую плиту для оценки как термической, так и механической гиперчувствительности и ее потенциального обращения.
Мыши, перенесшие операцию PSNL, продемонстрировали более низкие пороги механических раздражителей по сравнению с фиктивными животными в течение 28 дней. Аналогичные результаты были получены при оценке тепловой гиперчувствительности. Задержки вывода лап после воздействия лучистого теплового стимула были увеличены у животных PSNL, а также задержки отведения, когда животные были помещены на пластину с температурой 52 градуса Цельсия.
В группах, которым вводили две разные дозы морфина, наблюдалось изменение гиперчувствительности, которое длилось от одного до двух часов. Механическая гиперчувствительность вернулась к исходному уровню через четыре часа после инъекции морфина. Когда две разные дозы ибупрофена вводили мышам внутрибрюшинно, результаты продемонстрировали снижение механической гиперчувствительности по сравнению с мышами, которым вводили физиологический раствор.
Ограничение дополнительного повреждения нерва имеет важное значение, поскольку оно может повлиять на болевые сенсорные пороги. Экспериментатор должен обратить особое внимание и использовать стеклянный крючок, чтобы уменьшить непреднамеренное повреждение После этой процедуры эта модель хронической нейропатической боли может быть использована для выявления и характеристики антиноцицептивного эффекта лекарств, что приводит к разработке новых методов лечения боли.
