Этот протокол позволяет идентифицировать и количественно оценить вирус Зика, не полагаясь на цитопатический эффект. Это зависит от распознавания антителами компонента вируса. Использование вирус-специфических антител может помочь в выявлении различных серотипов вируса в смешанных популяциях.
Этот метод имеет преимущества перед классическими бляшеобразующими анализами. Он работает быстрее и подходит для высокопроизводительных приложений при использовании автоматизированной системы визуализации для быстрого подсчета клеток. Предлагаемый протокол обладает высокой адаптивностью.
При соответствующих модификациях предложенный протокол может быть применен к различным типам клеток и вирусным мишеням. Начните с выращивания клеток Vero в колбе для клеточной культуры площадью 75 квадратных = сантиметров, которая содержит 12 миллилитров DMEM с добавлением 10% FBS и двух миллимолей L-глютамина. Поместите колбу в инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Для инфицирования клеточного монослоя с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров удаляют питательную среду из колбы для клеточной культуры. С помощью пятимиллилитровой серологической пипетки дважды промойте колбу тремя миллилитрами ДПБС. Затем добавьте в колбу с клеточной культурой два миллилитра безсывороточного ДМЕМ и 20 микролитров инокулята вируса Зика.
Дайте колбе инкубироваться при комнатной температуре в течение одного часа, слегка покачивая, чтобы стимулировать адсорбцию вируса. По окончании инкубации с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки осторожно извлеките и выбросьте разведенный вирусный посевной материал из колбы с клеточной культурой. Дважды промойте колбу с клеточной культурой тремя миллилитрами DPBS.
Затем добавьте 12 миллилитров поддерживающей среды в колбу с клеточной культурой для поддержания инфицированных клеток. Инкубируйте зараженные клетки Vero в течение трех дней в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После трех дней инкубации используйте серологическую пипетку объемом 10 миллилитров, чтобы собрать надосадочную жидкость клеточной культуры, содержащую вирус Зика, в 50-миллилитровую центрифужную пробирку.
Для количественного определения вируса высейте клетки Vero в специально отведенные планшеты и дайте им расти в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия при 5%-ном содержании углекислого газа. Подготовьте шесть стерильных пробирок микроцентрифуг объемом 1,5 миллилитра для каждой пробирки для проведения десятикратного последовательного разведения, включая дополнительную пробирку для отрицательного контроля. Для установки 24-луночного планшета добавьте 450 микролитров безсывороточного DMEM во все шесть пробирок с микроцентрифугой.
Для установки 96-луночного планшета распределите 135 микролитров безсывороточного DMEM в шесть дополнительных пробирок. Чтобы провести серийное разведение для эксперимента с 24-луночным планшетом, добавьте 50 микролитров запаса вируса Зика в 10-минус одну пробирку, содержащую 450 микролитров безсывороточного DMEM. Для эксперимента с 96-луночным планшетом добавьте 15 микролитров запаса вируса Зика в 10-минус одну пробирку, содержащую 135 микролитров безсывороточного DMEM.
Вмешайте каждую пробирку, чтобы тщательно перемешать вирус и среду, обеспечив равномерное распределение вирусных частиц в разведении. Используя свежий наконечник пипетки, ресуспендируйте пробирку с 10 до минус одной пробирки и перенесите 50 и 15 микролитров разбавленного вируса Зика в пробирку с 10 до минус 2 в качестве второго десятикратного разведения для 24-луночных и 96-луночных планшетов соответственно. Извлеките и выбросьте кондиционную среду для каждой лунки соответствующей пластины.
Промойте каждую лунку DPBS дважды, чтобы удалить остатки. Начиная с самого высокого разведения, добавляйте последовательно разбавленный вирусный посевной материал в лунки, стремясь к наименьшему разведению. После одного часа инкубации извлеките и выбросьте вирусную суспензию из лунок, начиная с самой низкой до самой высокой концентрации.
Промойте зараженные клетки DPBS дважды, чтобы удалить любые следы вирусной суспензии. Наложите на лунку ДМЕМ и 1,5%-ную маловязкую карбоксиметилцеллюлозу. Инкубируйте планшет в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5%-ным углекислым газом.
После инкубации извлеките и выбросьте накладочную среду и трижды промойте клетки PBS. Для 96-луночного планшета используйте многоканальную пипетку, чтобы удалить и отбросить наплавленную среду, и промыть ячейки три раза 60 микролитрами PBS на лунку. Добавьте 4% параформальдегида для фиксации клеток и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 20 минут.
Через 20 минут выбросьте параформальдегид и трижды промойте клетки PBS. Затем добавляют 3,3'диаминобензидинпероксидазный субстрат и выдерживают планшет в течение 30 минут в темноте. Через 30 минут остановите реакцию, промыв лунки водой.
Просушите пластины на воздухе в течение ночи и приступайте к перебору очагов. Подсчитайте фокусы для каждого повторения выбранного разведения и вычислите среднее количество фокусов для каждого из них. Инфицированные клетки Vero фиксировались в разные моменты времени после заражения.
Для 2-луночного планшета первое появление вирусных очагов наблюдалось через 48 часов после заражения, хотя размер очагов был слишком мал для точного подсчета. Через 96 часов после заражения признаков отслоения клеток не было. Через 60 часов после заражения размер очагов увеличился до оптимального уровня для подсчета.
Впоследствии, с течением времени, очаги стали больше и начали сливаться или перекрываться друг с другом по интенсивности, образуя кластеры, которые со временем росли. Поэтому очаги, образовавшиеся через 60 часов после заражения, были выбраны для определения титра вируса Зика в 24-луночном планшете. В 96-луночном планшете клетки оставались нетронутыми через 72 часа после заражения.
Появление вирусных очагов впервые наблюдалось через 24 часа после заражения. Однако в течение 36 часов после заражения размер очагов был слишком мал. Оптимальный размер очагов был достигнут через 48 часов после заражения.
В последние моменты времени наблюдались перекрывающиеся или объединенные очаги, и количество перекрывающихся очагов увеличивалось с течением времени. Очаги, образующиеся через 48 часов после выбора инфекции, были выбраны для определения титра вируса изолятов вируса Зика. Осторожно добавьте DPBS вниз по стенке каждой лунки и покачайте пластины вперед и назад от одного до трех раз, чтобы удалить клеточный мусор и излишки среды.
Этот метод принесет большую пользу исследователям, занимающимся исследованиями вируса Зика, а также может быть широко адаптирован для количественной оценки других клинически важных вирусов, что делает его ценным инструментом для эпиднадзора и диагностики вирусов.
