Наш протокол обеспечивает щадящий метод инокуляции и экстракции растений, который позволяет восстанавливать бактериальные популяции, выращенные в листовом апопласте, подходящем для анализа экспрессии одноклеточных генов, такого как проточная цитометрия. Этот метод позволяет извлекать значительное количество бактерий из апопласта без значительного загрязнения образцов растительными клеточными остатками. Этот оптимизированный метод восстановления апопластических бактерий может быть применен непосредственно или с незначительными изменениями к ряду растительных бактериальных систем, включающих либо растительные патогенные бактерии, либо полезные эндоцитарные бактерии.
Продемонстрирует процедуру Ньевес Лопес-Паган, аспирант нашей лаборатории. Для начала заполните горшок диаметром 10 сантиметров предварительно политой смесью субстрата для растений вермикулита в соотношении 1:3. Накройте горшок перфорированной металлической сеткой и приспособьте металлическую сетку к влажной почве с помощью резинки.
Далее посейте семена арабидопсиса в отверстия металлической сетки влажной зубочисткой. Поместите три-четыре семени в отдаленные места в горшке. Накройте горшок пластиковым куполом для поддержания высокой относительной влажности и инкубируйте для стратификации при четырех градусах Цельсия в течение 72 часов.
Перенесите горшок в камеру для выращивания растений в условиях короткого дня. Чтобы открыть горшок, снимите пластиковый купол. Как только семена прорастут, пинцетом удалите большую часть рассады, оставив по одному саженцу в каждом из положений горшка.
Затем подготовьте растения фасоли Phaseolus vulgaris, накрыв дно чашки Петри влажным бумажным полотенцем и положив на него семена фасоли. Запечатайте чашку Петри хирургической лентой и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение трех-четырех дней. Перенесите пророщенные семена в горшок диаметром 10 сантиметров, наполненный влажной смесью субстрата для растений с вермикулитом в соотношении 1:3, и инкубируйте в камере для выращивания растений в условиях длительного дня.
Вылейте запас глицерина интересующего штамма Pseudomonas syringae при температуре от минус 80 градусов по Цельсию в пластину LB, дополненную соответствующими антибиотиками. Инкубируйте тарелку при температуре 28 градусов Цельсия в течение 40-48 часов. Соскребите бактериальную биомассу и ресуспендируйте ее в пяти миллилитрах 10-миллимолярного хлорида магния.
Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах и отрегулируйте ее до 0,1, добавив 10-миллимолярный хлорид магния. Выполняйте последовательные разведения в 10-миллимолярном хлориде магния, чтобы получить конечную концентрацию инокулята от пяти раз до 10 до пятого КОЕ на миллилитр. Затем подготовьте 200 миллилитров инокулята для растений арабидопсиса и 50 миллилитров для бобовых растений.
Перед инокуляцией добавьте поверхностно-активное вещество Silwet L-77 до конечной концентрации 0,02% для инокуляции фасоли и 0,01% для арабидопсиса. Для инфильтрации арабидопсиса поместите две деревянные палочки, образующие крестик, над горшком и поместите горшок лицевой стороной вниз на чашку Петри диаметром 14 сантиметров, содержащую 200 миллилитров инокулята. Для инокуляции листьев фасоли вставьте растения и раствор инокулята в вакуумную камеру и введите лист в 50-миллилитровую коническую центрифужную трубку, содержащую инокулят.
Дайте импульс 500 миллибар в течение 30 секунд, чтобы проникнуть в листья. Слейте излишки раствора инокулята с помощью листа бумаги и верните планы в соответствующую камеру роста. Через четыре дня после прививки срежьте либо надземную часть растения арабидопсиса, либо привитый лист с растения фасоли и поместите его в 20-миллилитровый шприц без иглы.
Для листьев фасоли сверните лист на себя, оставив абаксиальную поверхность наружу. Добавьте достаточный объем дистиллированной воды, чтобы покрыть ткань. Затем вставьте поршень, удерживающий шприц в вертикальном положении, и удалите лишний воздух и пузырьки воздуха внутри шприца, осторожно постукивая по стволу, пока весь воздух не окажется возле наконечника, и, удалив воздух, накройте наконечник ствола шприца парафиновой пленкой.
Теперь осторожно нажмите на поршень, чтобы создать положительное давление, пока ткань не потемнеет. Затем потяните за поршень, чтобы создать отрицательное давление. Удалите парафиновую пленку и поршень и соберите жидкость, содержащую бактерии, извлеченные из апопласта.
Для одноклеточного анализа приготовьте 1,5%-ный раствор агарозы в дистиллированной воде. После расплавления добавьте достаточно объема, чтобы заполнить пространство между двумя предметными стеклами микроскопии, установленными рядом, и поместите сверху еще одно предметное стекло. Дайте им покататься в течение 15 минут и осторожно снимите горку, расположенную сверху.
С помощью лезвия разрежьте агарозную подушечку на кусочки размером пять миллиметров на пять миллиметров перед использованием. Параллельно центрифугируйте один миллиметр бактерий, экстрагированных апопластом. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и суспендируйте гранулу в 20 микролитрах воды, чтобы сконцентрировать клетки.
Поместите двухлитровую каплю концентрированных клеток на 0,17-миллиметровый покровный листок и накройте каплю кусочком агарозной подушечки. Визуализируйте бактериальный препарат под конфокальным микроскопом, чтобы идентифицировать зеленые флуоресцентные бактерии с помощью специальных лазеров. Определите все бактерии с помощью светлого поля и объедините оба поля.
Чтобы выполнить анализ с помощью проточной цитометрии, возьмите аликвоту суспензий бактерий, экстрагированных апопластом. Проведите анализ с помощью проточного цитометра и получите 100 000 событий. Экспрессия hrpL GFP контролируется флуоресценцией GFP.
На точечных графиках показано распределение интенсивности флуоресценции GFP в зависимости от размера клеток в популяции, а гистограммы показывают интенсивность флуоресценции GFP в зависимости от количества клеток. Процентное содержание hrpL ON было выше, чем соответствующее процентное соотношение hrpL OFF. Изображения флуоресцентной микроскопии показывают гетерогенные уровни GFP, связанные с экспрессией hrpL.
Наблюдаются бактерии, демонстрирующие низкую флуоресценцию GFP или отсутствующую ее. Для достижения оптимальных результатов будьте осторожны на этапах экстракции бактерий, чтобы не повредить растительную ткань и, таким образом, ограничить загрязнение клеточным содержанием растений. Полученные образцы бактерий могут быть использованы для других целей, где снижение загрязнения растений является преимуществом, таких как экстракция нуклеиновых кислот для последующего бактериального геномного или транскриптомного анализа.
