Этот протокол важен для производства эпителиальных органоидов памяти, которые генерируются без пассажа. Основное преимущество этого метода заключается в том, что органоиды могут быть выделены из ткани молочной железы и памяти человека и мыши после ферментативного пищеварения. Мы выполняем серию этапов дифференциального центрифугирования, которые изолируют эпителиальные органоиды без необходимости прохождения клеток.
Человек, выполняющий эту технику, может столкнуться с проблемами при встраивании тканей в коллаген или матрикс и нанесении их на 96-луночную пластину. Кроме того, использование правильно полимеризованного коллагена и покрытие стабильных куполов является ключом к обнаружению вторжения. Для начала соберите ткань молочной железы усыпленной мыши, растопырив конечности мыши и используя четыре иглы 19 калибра, прикрепите мышь за лапы к доске, покрытой впитывающей прокладкой брюшной стороной вверх.
Сбрызните 70% этанолом, чтобы разгладить шерсть и продезинфицировать кожу, а также вытрите фекалии марлевой салфеткой или салфеткой. Начиная чуть выше аногенитальной области, разрежьте вверх от средней линии хирургическими ножницами, стараясь не проткнуть брюшину. Достигнув подбородка, сделайте боковые надрезы вниз по обеим ключицам и вниз по задним лапам и прижмите натянутую кожу мыши к доске, чтобы обнажить жировые подушечки молочной железы.
После обнаружения паховых и грудных жировых подушечек молочной железы у мышей дикого типа используйте щипцы, чтобы поднять жировую подушку молочной железы. Используя тупой конец острых тупых ножниц, создайте карман под жировой подушкой молочной железы подальше от кожи и отрежьте жировую подушечку молочной железы одним целым куском. После удаления жировых отложений молочной железы промойте их в PBS перед помещением в стерильную чашку для культивирования тканей, а затем быстро перенесите в капюшон для культивирования тканей.
Измельчите опухоли молочной железы скальпелем No 10 или No 11, чтобы ослабить ткань, пока она не достигнет пастообразной консистенции. Переведите измельченную ткань в коническую трубку, содержащую от 10 до 30 миллилитров раствора коллагеназы, с помощью скальпеля. Чтобы убедиться, что вся ткань собрана, пипеткой нанесите один миллилитр раствора коллагеназы на пластину для культивирования тканей и обратно в коническую трубку.
Поместите коническую трубку в настольный встряхивающий инкубатор до тех пор, пока ткань не станет волокнистой, а раствор коллагеназы не помутнеет. Отварите 50 миллилитров раствора в течение пяти-10 минут при 1 500 об/мин. Вдохните надосадочную жидкость, добавьте 12 миллилитров базальной среды и перемешайте, пипеткой вверх и вниз три-четыре раза или осторожно поверните запястье, удерживая трубку 15 раз.
Опять же, открутите надосадочную жидкость аспирата, добавьте базальную среду и перемешайте пипеткой или вращением трубки, как показано ранее. Как только самые тяжелые фрагменты ткани осядут на дно, соберите надосадочную жидкость серологической пипеткой и перенесите ее в коническую трубку объемом 15 миллилитров. После каждого центрифугирования следите за тем, чтобы гранулы становились все более непрозрачными.
Аликвота соответствующая суспензия органоидов в микроцентрифужные пробирки в соответствии с плотностью органоидов по отношению к количеству BECM на лунку. Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки в течение 10 минут при 300 G при комнатной температуре и выбрасывайте надосадочную жидкость из пробирок. Переместите пробирки с органоидными гранулами на лед и добавьте соответствующий объем BECM в каждую микроцентрифужную пробирку.
Аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать органоиды в BECM, стараясь не образовывать пузырьков. Медленно и осторожно нанесите взвешенные органоиды BECM на поверхность покрытия пипеткой и заполните все пустые лунки PBS для поддержания влажности. Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на один час, чтобы дать BECM затвердеть, а затем накройте средой соответствующего объема.
Чтобы приготовить раствор коллагена, смешайте 375 микролитров с концентрацией в 10 раз превышающей концентрацию DMEM, 100 микролитров одного нормального гидроксида натрия и три миллилитра раствора коллагена I крысиного хвоста в конической трубке объемом 15 миллилитров. Пипетку перемешайте, стараясь не образовывать пузырьков, и титруйте раствор до рН от 7,2 до 7,4 с небольшим количеством гидроксида натрия или концентрацией ДМЭМ, в 10 раз превышающей концентрацию ДМЭМ по мере необходимости. Покройте дно лунок минимальным количеством коллагена, необходимым для полного покрытия дна лунки, поместив небольшое количество коллагена, и раскачивайте пластину из стороны в сторону, чтобы покрыть.
Дайте коллагеновой подложке застыть при температуре 37 градусов по Цельсию в течение от 30 минут до двух часов. Аликвотировать соответствующую суспензию органоидов в микроцентрифужные пробирки в соответствии с плотностью органоидов по отношению к количеству коллагена в лунке. Храните раствор коллагена при четырех градусах Цельсия и контролируйте полимеризацию, проверяя образование волокон под микроскопом каждые 10 минут.
Центрифугируют микроцентрифужные пробирки при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают надосадочную жидкость из пробирок. Переместите гранулы органоидов в лед и добавьте соответствующий объем коллагена в каждую микроцентрифужную пробирку. Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать органоиды в коллагене, стараясь не образовывать пузырьков.
Медленно и осторожно нанесите суспендированные органоиды коллагена пипеткой на поверхность покрытия. Иммунофлуоресцентные изображения встроенных органоидов в базальном внеклеточном матриксе или коллагене были получены для изучения сходства межвидового состава тканей. Органоиды, встроенные в коллагеновую матрицу, могут быть использованы для анализа инвазии и проанализированы путем отслеживания расширения усиков, ответвляющихся от самого органоида, либо через мембранную маркировку томатов, либо через окрашивание актина фаллоидином.
Наконец, окрашивание гематоксилином и эозином органоидов, встроенных в парафин, показывает, что органоиды сохраняют ту же гистологию рака молочной железы. Крайне важно, чтобы BECM и коллаген оставались холодными во время пипетки гелеобразных куполов, чтобы избежать преждевременной полимеризации. Кроме того, длительная фиксация куполов в PFA приведет к образованию гелеобразного раствора при выполнении иммунофлюоресцентного окрашивания.
Органоиды также могут быть использованы в процедурах in vitro и in vivo, таких как скрининг лекарств и мышиные модели метастазирования. Эти методы могут дать представление о терапевтической чувствительности опухолевой ткани, метастатических свойствах и иммунных взаимодействиях.
