Это исследование демонстрирует новый подход к изучению терапии и патобиологии аппендикулярного рака в доклинических условиях. Эти методы могут быть более широко применимы для изучения других злокачественных новообразований. Аппендикулярный рак трудно изучать, учитывая его низкую заболеваемость при отсутствии аппендикса у мышей для моделирования заболевания.
Этот метод позволяет изучать клеточные взаимодействия в микроокружении опухоли. Этот метод может быть применен для изучения биологии нескольких видов рака, которые имеют склонность к метастазированию в сальник, таких как колоректальный рак и рак яичников. Начните с подготовки транспорта и питательных сред.
По прибытии ткани переносят опухолевые ткани псевдомиксомы брюшины в 35 полных DMEM, содержащих чашки диаметром шесть сантиметров. В дополнение к удалению любого разжиженного муцина или областей высокомуцинозной ткани, удалите любую ткань, которую трудно разрезать скальпелем. Разрезают узлы опухолевой ткани примерно на один кубик сантиметра помельче.
для приготовления агарозы и заделки тканей приготовьте 5%-ный раствор слабоплавкой агарозы в PBS без эмбриональной бычьей сыворотки или FBS в тот же день, если ткани поступят. Добавьте жидкий 5%-ный раствор агарозы в шестисантиметровые чашки, содержащие два-три меньших образца опухоли, пока он не покроет образец. Поместите встроенные салфетки в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия на 30 минут.
Демонтируйте образцы тканей на вибратоме, достаньте затвердевший шнек из холодильника и нарежьте кубики агарозы немного больше ширины ткани с помощью скальпеля. Нанесите суперклей на стадию вибратома и аккуратно поместите кубик агарозы на суперклей на одну-две минуты для фиксации. Закрепите лезвие на вибратоме и установите толщину среза ткани примерно от 150 до 250 микрон для оптимальной последующей визуализации.
Чтобы культивировать срезы ткани, подготовьте проницаемую вставную пластину, добавив два миллилитра полной среды DMEM над проницаемой мембраной и три миллилитра под проницаемой мембраной. Затем аккуратно извлеките кусочки ткани из режущей камеры вибратома с помощью тонкой кисти и поместите от двух до четырех ломтиков в проницаемые чашки для культуры, содержащие полный DMEM. Культивируйте срезы до семи дней при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислого газа.
Во время замены среды каждые 24 часа добавляйте бортезомиб в качестве контроля для уничтожения клеток и тестируемую химиотерапию 5-фторурацилом или 5-ФУ в питательные среды для выполнения фармакологического вмешательства. Поместите срезы опухоли для анализа конфокальной визуализации в одну лунку 12-луночной чашки, содержащей PBS с 1% FBS. Для экспериментов по визуализации кальция вместо PBS инкубируйте срезы во внеклеточном растворе кальция.
Окрашивайте образцы визуализирующими красителями, чтобы определить жизнеспособность срезов ткани. Инкубировать от 10 минут до одного часа после добавления красителя жизнеспособности. После инкубации перенесите ломтики в чашку Петри с оптически прозрачным стеклянным дном, содержащую PBS с 1% FBS, для использования для визуализации на конфокальном устройстве визуализации.
Отрежьте небольшой кусочек от конца наконечника пипетки объемом один миллилитр, чтобы расширить отверстие, обеспечивая энергичную механическую диссоциацию путем пипетки. Инкубируйте ломтики при температуре 37 градусов Цельсия с вращением в течение пяти-15 минут в одном миллилитре буфера для переваривания, с энергичным разрушением тканей два-три раза во время инкубации с использованием механической диссоциации. После того, как ткань переварится, перенесите разрушенную ткань со средой для разложения на 70-микрометровый фильтр, помещенный поверх конической трубки объемом 50 миллилитров.
Собирайте более крупные кусочки с помощью стерильных щипцов или пипетки. Используя тупую заднюю часть пластикового пятимиллилитрового шприца, разомните любые более крупные недиссоциированные ломтики и промойте их четырьмя миллилитрами PBS, содержащими 2% FBS. Возьмите надосадочную жидкость диссоциированной клетки и центрифугу при 300 г в течение пяти-10 минут.
Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулы одним миллилитром PBS, содержащим 2% FBS. Чтобы подготовить образец к проточной цитометрии, добавьте блокирующий буфер, содержащий 50 микролитров человеческого блока FC, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Выполните внеклеточное окрашивание с использованием соответствующих антител в 50 микролитрах PBS, содержащих 2% FBS.
Аликвотируйте пять миллилитров полной среды для контроля и условий обработки. На два-четыре ломтика, нанесенных на проницаемую посуду, добавьте среду из аликвот контрольной обработки и дополнительную комбинированную терапию, которая будет использоваться для последующего анализа жизнеспособности живых мертвецов. Оставьте срезы ткани в культуре, содержащей полный ДМЭМ, на два-пять дней, меняя среду, а также бортезомиб и 5-ФУ через день.
Для люминесцентного анализа жизнеспособности добавьте 500 микролитров PBS в 12-луночную чашку и перенесите последовательно подобранные срезы ткани в раствор PBS с помощью кисти или пипетки объемом один миллилитр. Удалите PBS со срезов. Добавьте 500 микролитров люминесцентного раствора жизнеспособности в каждом условии и инкубируйте с медленным вращением на шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут перед считыванием люминесценции с помощью считывателя люминесцентных пластин.
Окрашивание муцина в срезах тканей визуализировали с помощью периодического окрашивания кислотным сдвигом и муцин-специфических антител. Инкубация в кальцеине AM и йодиде пропидия определяла здоровье и жизнеспособность. Ядра перекрывали клетки, размножавшиеся во время культивирования.
Эти результаты были количественно оценены для определения количества пролиферирующих клеток в опухолевом срезе. Срезы, инкубированные в конъюгированном антителе CD11b PE и Fluo-4 AM, мечены местными иммунными клетками в CTU. Псевдоцветные масштабированные изображения, показывающие внутриклеточные уровни кальция, позволили визуализировать дифференциальные уровни внутриклеточного кальция.
Здесь показана отслеживаемая спонтанная активность и промежуток времени до, во время и после межклеточного кальциевого ответа в выделенной CD11b-положительной иммунной клетке. Необработанные следы кальциевых реакций в иммунной клетке CD11b, наряду с другими чувствительными и нечувствительными клетками, были количественно определены. Представлены репрезентативные результаты иммунотипирования образца опухоли пациента с псевдомиксомой брюшины.
Количественная оценка иммунопрофиля опухоли показала, что донорский образец 337 имеет высокие уровни макрофагов M2, что указывает на то, что использование срезов ткани, полученных из псевдомиксомы брюшины, позволило исследовать уникальный донорский клеточный ландшафт образцов опухоли пациента. Фармакотипирование и последующий анализ срезов тканей из тканей псевдомиксомы брюшины человека показали гибель клеток в опухолевых срезах, что подтверждается анализом цитотоксичности и туннельно-конфокальной визуализацией. В ответ на цитостатический препарат применяют бортезомиб и 5-фторурацил.
Люминесцентный анализ жизнеспособности проводили с использованием последовательно подобранных срезов. Успешное производство срезов муцинозных опухолей требует тщательного вскрытия и удаления клеточных и бесклеточных компонентов ткани, таких как жир и плотная ткань брюшной стенки. Этот метод может позволить моделировать взаимодействия между раковыми клетками и несколькими типами клеток в микроокружении опухоли, такими как взаимодействия жировых, сосудистых и иммунных клеток.
