Этот метод доставляет генетический материал в эпителиальные клетки молочной железы особым, временным и количественно контролируемым образом. Поскольку доставка генетического материала в эпителиальные клетки молочной железы является специальным, временно и количественно контролируемым, модели молочной железы, генерируемые этим методом, лучше имитируют естественный опухолевый генез. Начните подготовку шприца, отрезав металлические иглы-концентраторы 33 калибра примерно до одного сантиметра и храня их в спирте.
Извлеките шприцы и иглы из спирта и вытолкните оставшийся спирт из шприца и игл. Затем разберите шприц для сушки на воздухе. После высыхания соберите шприц.
Достаньте вирусные бульонные тюбики из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов по Цельсию и разморозьте их на льду. Чтобы добавить бромфеноловый синий, окуните наконечник пипетки на глубину одного сантиметра в порошок бромфенольного синего. Затем добавьте прикрепленное следовое количество бромфенолового синего в вирусную суспензию.
Смешайте бромфеноловый синий с раствором вируса, пипеткой вверх и вниз 10 раз, прежде чем поместить вирус на лед. Проверьте глубину анестезии, ущипнув палец ноги анестезированной самки мыши. Наносите мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость, пока животное находится под наркозом.
Положите мышь в лежачем положении на теплую подушечку и прикрепите все четыре конечности к скамейке с помощью скотча. Определите сосок, который нужно ввести, и обнажьте его, подстригая окружающие волосы с помощью ножниц. Нанесите 70%-ный спирт и йоту четыре тампона тремя чередующимися раундами на область соска, чтобы очистить и обнажить сосок.
Сделайте разрез дистального кончика соска с помощью пары стерилизованных пружинных ножниц для микрорассечения, пока под лупой не появится небольшое центральное отверстие протока. Затем загрузите в шприц 10 микролитров смеси вирусного бромфенольного синего и аккуратно вставьте иглу в отверстие соска с помощью лупы. Введите все 10 микролитров вируса в дерево протоков и поместите мышь на горку с температурой 45 градусов по Цельсию, пока мышь полностью не проснется.
Вскрывают грудную полость через три-пять дней после инъекции вируса. Разрежьте кожу по вентральной средней линии, а также верхние и нижние конечности с помощью ножниц. Поднимите кожу и обнаживите молочные железы.
Удалите введенную молочную железу с кожи и неинъецированную железу в качестве контроля с помощью щипцов и ножниц. После этого поместите молочную железу на предметное стекло и раздвиньте железу до ее первоначальной формы, прежде чем наблюдать и визуализировать ее под флуоресцентным стереомикроскопом. Успех внутрипротоковой инъекции был подтвержден обнажением молочной железы и наблюдением за голубым протоковым деревом.
Через два-пять дней после инъекции вируса lenti-EGFPFUCGW эпителиально-клеточную инфекцию молочной железы оценивали путем наблюдения за всей подготовкой крепления под флуоресцентным стереомикроскопом. Для проточного цитометрического анализа флуоресцентных белков или маркеров клеточной поверхности, продуцируемых вирусом, неинфицированные железы и инфицированные железы были собраны и обработаны в одноклеточную суспензию для оценки скорости вирусной инфекции. Активированный ERBBB2 приводил к предраковым поражениям через несколько недель и опухолям через несколько месяцев.
Размер сосков может значительно варьироваться из-за различий в массе, возрасте, массе тела и силе у отдельных мышей. Правильная обрезка кончика соска для обнажения отверстия молочного протока и подгонки иглы является важным шагом для успешного введения вируса.
