Этот протокол обеспечивает надежную справочную информацию для получения высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для облегчения исследований на уровне отдельных клеток у видов рыб аквакультуры. Технология отличается высокой эффективностью и может быть реализована в большинстве лабораторных условий. Это снижает потребность в дополнительных испытаниях для приготовления одноклеточных суспензий для видов рыб аквакультуры.
Начните с ополаскивания шестимесячной рыбы нильской тилапии в хорошо аэрированной стерильной воде в течение 15 минут, чтобы смыть неплотно связанные бактерии с поверхности. Для приготовления ферментативного реагента для диссоциации клеток разбавьте диспазу коллагеназы в PBS до конечной концентрации один миллиграмм на миллилитр. Смешайте 95% объема приготовленного ферментативного раствора и 5% объема FBS.
Затем предварительно охлаждают центрифугу до четырех градусов Цельсия перед использованием. Для рассечения тканей поместите усыпленную рыбу на лед и соберите три-четыре сантиметра средней части кишечника. Иссекают жир и брыжейку с помощью щипцов.
Удалите жир, прикрепленный к поверхности кишечника, и эластичную и податливую прозрачную слизистую оболочку. Аккуратно промойте фрагмент кишечника стерильным ледяным PBS с помощью шприца, чтобы смыть содержимое кишечника и слизь. После нескольких промывок рассеките фрагмент на мелкие кусочки и переложите их в пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр ледяного PBS.
Центрифугируйте смесь при температуре 300 x g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. И замените надосадочную жидкость одним миллилитром ледяного 0,08% BSA-DPBS. С помощью стеклянной пипетки аккуратно аспирируйте, чтобы ресуспендировать фрагменты ткани.
Промыв кусочки еще раз, удалите надосадочную жидкость и добавьте один миллилитр приготовленного ферментативного диссоциирующего реагента. Также смешайте пять микролитров ингибитора РНК с реагентом диссоциации для секвенирования одноклеточной РНК. Поместите пробирку на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия и вручную переворачивайте пробирку каждые пять минут в течение 30-60 минут инкубации.
После того, как трубки будут раскручены, удалите ферментативный реагент для диссоциации клеток с помощью широкопроходных наконечников. Добавьте один миллилитр ледяного 0,08% BSA-DPBS и аккуратно пипеткой нанесите на клетки вверх и вниз, чтобы предотвратить разрушение клеток. После центрифузии и ресуспендирования клеток еще раз поместите 40-микрометровый сетчатый фильтр, предварительно смачиваемый 0,08% BSA-DPBS, на коническую пробирку объемом 50 миллилитров.
Пропустите клеточную суспензию через ситечко. Постучите по ситечку, затем промойте его 200 микролитрами DPBS и соберите суспензию на дне пробирки. После переноса суспензии в пробирку объемом 1,5 миллилитра добавьте пять микролитров ДНК и инкубируйте суспензию в течение 15 минут при температуре от 15 до 20 градусов Цельсия.
После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу клетки в 400 микролитрах ледяного DPBS без ионов кальция и магния. Затем аккуратно пипеткой вверх и вниз с широкими наконечниками, чтобы перемешать клетки, и повторите этот процесс еще раз. Для окрашивания смешайте клеточную суспензию в 0,4%-ном растворе трипанового синего в равном соотношении и выдержите три минуты при комнатной температуре.
Затем добавьте 10 микролитров смеси на предметное стекло. Подсчитайте жизнеспособные и мертвые клетки под микроскопом в трех полях и рассчитайте процент жизнеспособности клеток. Было проведено сравнение эффективности диссоциации нескольких широко используемых ферментов.
Было подтверждено, что смесь диспазы коллагеназы обладает лучшим эффектом диссоциации, чем только диспаза коллагеназы или трипсин и несколько других ферментных смесей. Микроскопическое исследование показало, что клетки кишечника обладают высокой жизнеспособностью и рассеиваются в виде одиночных клеток. Большинство клеток были жизнеспособными, в то время как некоторые из них были окрашены мертвыми из-за проницаемой клеточной мембраны.
Обратите внимание на тип используемого PBS. Ферментативный раствор для пищеварения нельзя использовать с PBS, не содержащим кальция / магния, поскольку для эффективного функционирования фермента требуются ионы кальция / магния. Эта процедура облегчает исследования на уровне отдельных клеток видов рыб аквакультуры, обеспечивая ценный ориентир для разработки протоколов диссоциации клеток видов рыб аквакультуры.
