Кристаллизация диализом является недостаточно используемым методом. Этот протокол представляет собой подход Novo к этому, который расширит диапазон стратегий кристаллизации, доступных в настоящее время для структурированного определения. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он обладает высокой пропускной способностью, прост в настройке без специального оборудования и позволяет легко контролировать рост кристаллов.
Человек, выполняющий эту технику, должен чувствовать себя комфортно при малообъемном пипетировании и использовании многоканальных пипеток. Капли необходимо пипетировать как можно в достаточной степени, чтобы предотвратить частичное обезвоживание. Чтобы начать эксперимент по микродиализу, поместите коммерчески доступную 96-луночную пластину для микродиализа в ориентацию белка вверх и удалите клейкую покровную ленту, отклеив 200-микронную клейкую прокладку под давлением.
Отклеив клейкую покровную ленту, обратите внимание на положение скважины А1. Затем с помощью многоканальной пипетки загрузите в каждую лунку максимум 3,2 микролитра правильно подготовленного образца белка. Правильно расположите 200-микронную УФ-пленку над 96-луночной пластиной пленкой вверх. Затем, чтобы активировать и запечатать прижимной клей, надавите на УФ-пленку с помощью уплотнительной лопатки и проверьте ее целостность.
Теперь переверните пластину, чтобы привести ее к ориентации буферной стороной вверх, и обратите внимание на зеркальное положение отмеченной скважины A1. Используя многоканальную пипетку, загрузите максимум 350 микролитров диализирующего раствора в каждую лунку пластины и тщательно запечатайте лунки пленкой крышки резервуара. Затем поместите пластину буферной стороной вверх внутрь подходящего инкубатора с регулируемой температурой при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы обеспечить рост кристаллов. Чтобы исследовать образование кристаллов под микроскопом, снимите защитную пленку с 200-микронной УФ-пленки и поместите пластину под окуляр белковой стороной вверх.
Чтобы провести крупномасштабный эксперимент по кристаллизации, примите условия, в которых происходил рост микрокристаллов в микродиализной пластине, и воспроизведите те же условия в больших контейнерах. Размер емкости подбирается в зависимости от объема диализирующего раствора. Пипетка максимального объема 500 микролитров образца белка помещается в пробирку диализатора перед запечатыванием пробирки с помощью красного пластикового колпачка.
Поместите герметичную пробирку диализатора объемом 500 микролитров в плавающую стойку внутри контейнера, заполненного диализирующим раствором. Затем поместите контейнер в подходящий инкубатор с регулируемой температурой при температуре 20 градусов Цельсия для достижения роста кристаллов. Чтобы проверить образование кристаллов, пипеткой нанесите один-два микролитра раствора из диализатора на предметное стекло.
Накройте раствор на предметном стекле другим предметным стеклом и рассмотрите его под микроскопом. Изображения, полученные с помощью стереомикроскопа с большим увеличением, показали успешное образование микрокристаллов четырех белков с использованием микродиализных пластин с 10-килодальтонными мембранами с молекулярной массой. Было обнаружено, что лизоцим образует кристаллы при диализе против 0,1 молярного ацетата натрия при рН 4, содержащего соответствующие добавки.
Доматин образовывал кристаллы при диализе против 0,1 молярного бис-триса пропана при рН 6,6, содержащего соответствующие добавки. Оптимизированные условия диализа привели к образованию микрокристаллов мембранными белками, а именно белком мультилекарственного насоса E.coli AcrB и переносчиком лактозы E.coli LacY. Крупномасштабная кристаллизация в пробирках диализатора с использованием оптимизированных условий диализа, полученных в результате экспериментов по микродиализу, привела к образованию тысяч микрокристаллов для каждого из белков.
Для кристаллизации фомитина диализовали 250 микролитров белка против 50 миллилитров диализирующего раствора. Для AcrB диализовали 250 микролитров белка против 25 микролитров диализного раствора. Кристаллизация LacY также была установлена в том же соотношении: 100 микролитров белка на 10 миллилитров диализного раствора.
При переворачивании пластины буферной стороной вверх важно отметить положение A1, чтобы можно было соответствующим образом распределить растворы из кристаллизационного экрана. Кристаллы, полученные с помощью этого метода, могут быть использованы для последующих применений, таких как серийная кристаллография и микроэректильная дисперсия.
