투석에 의한 결정화는 활용도가 낮은 방법입니다. 이 프로토콜은 이에 대한 Novo 접근 방식을 제시하며, 이는 현재 구조화된 결정에 사용할 수 있는 결정화 전략의 범위를 증가시킬 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 처리량이 높고 전문 장비 없이 설정이 간단하며 결정 성장을 쉽게 모니터링할 수 있다는 것입니다.
이 기법을 수행하는 개인은 소량 피펫팅 및 멀티채널 피펫 사용에 익숙해야 합니다. 방울은 부분 탈수를 방지하기 위해 가능한 한 충분히 피펫팅해야 합니다. 미세 투석 실험을 설정하기 위해 시중에서 판매되는 96웰 미세 투석 플레이트를 단백질 면이 위로 향하게 놓고 200미크론 압력 접착 스페이서를 떼어내어 접착 커버 테이프를 제거합니다.
접착 커버 테이프를 떼어낸 후 웰의 위치를 기록하십시오 A1. 다음으로, 다중 채널 피펫을 사용하여 적절하게 준비된 단백질 샘플을 최대 3.2마이크로리터까지 각 웰에 로드합니다. 필름이 위를 향하도록 하여 200웰 플레이트 위에 96미크론 UV 커버 필름을 적절하게 배치합니다. 그런 다음 압력 접착제를 활성화하고 밀봉하려면 밀봉 패들을 사용하여 UV 커버 필름을 누르고 무결성을 확인하십시오.
이제 플레이트를 뒤집어 버퍼 면이 위로 향하도록 하고 표시된 웰 A1의 미러링 위치를 기록해 둡니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 최대 350마이크로리터의 투석 용액을 플레이트의 각 웰에 로드하고 저장소 커버 필름으로 웰을 조심스럽게 밀봉합니다. 그런 다음 결정 성장을 허용하기 위해 섭씨 20도에서 적절한 온도 제어 인큐베이터 내부의 버퍼 측면이 위로 향하도록 플레이트를 놓습니다. 현미경으로 결정 형성을 검사하려면 200미크론 UV 커버 필름에서 보호 커버 필름을 제거하고 단백질 면이 위쪽을 향하도록 하여 플레이트를 접안렌즈 아래에 놓습니다.
대규모 결정화 실험을 설정하려면 미세 투석판에서 미세 결정 성장이 발생하는 조건을 채택하고 대형 용기에서 동일한 조건을 복제합니다. 투석액의 양에 따라 용기 크기를 선택하십시오. 최대 부피 500마이크로리터의 단백질 샘플을 투석기 튜브에 피펫팅한 후 빨간색 플라스틱 캡을 사용하여 튜브를 밀봉합니다.
밀봉된 500마이크로리터 투석기 튜브를 투석액으로 채워진 용기 내부의 플로팅 랙에 넣습니다. 다음으로, 결정 성장을 달성하기 위해 섭씨 20도의 적절한 온도 제어 인큐베이터 내부에 방해받지 않고 용기를 놓습니다. 결정의 형성을 확인하기 위해, 투석기에서 1 내지 2 마이크로리터의 용액을 유리 커버 슬라이드 위로 피펫팅한다.
슬라이드의 용액을 다른 유리 슬라이드로 덮고 현미경으로 봅니다. 입체 고배율 현미경을 사용하여 캡처한 이미지는 10킬로달톤 분자량 컷오프 멤브레인이 있는 미세 투석 플레이트를 사용하여 4개의 단백질이 성공적으로 미세 결정이 형성되었음을 보여주었습니다. 리소자임은 적절한 첨가제를 함유하는 pH 4에서 0.1몰 아세트산나트륨에 대해 투석될 때 결정을 형성하는 것으로 밝혀졌습니다.
도마틴은 적절한 첨가제를 함유하는 pH 6.6에서 0.1몰 비스-트리스 프로판에 대해 투석될 때 결정을 형성하였다. 최적화된 투석 조건은 막 단백질, 즉 E.coli 다제 유출 펌프 단백질 AcrB 및 E.coli 유당 수송체 LacY에 의한 미세결정 형성으로 이어졌습니다. 미세 투석 실험에서 얻은 최적화된 투석 조건을 사용하는 투석기 튜브의 대규모 결정화는 각 단백질에 대해 수천 개의 미세 결정을 형성했습니다.
포미틴의 결정화를 위해, 250 마이크로리터의 단백질을 50 밀리리터의 투석 용액에 대해 투석하였다. AcrB의 경우, 250 마이크로리터의 단백질을 25 마이크로리터의 투석 용액에 대해 투석하였다. LacY 결정화는 또한 100 마이크로리터의 단백질과 10 밀리리터의 투석 용액을 사용하여 동일한 비율로 설정되었습니다.
플레이트를 버퍼 면이 위로 향하도록 뒤집을 때 결정화 스크린의 용액이 그에 따라 분배될 수 있도록 A1의 위치를 기록하는 것이 중요합니다. 이 방법에서 얻은 결정은 직렬 결정학 및 마이크로 ED와 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
