Использование КАМ для наблюдения за ранними изменениями после трансплантации ткани яичников имеет существенное преимущество перед моделями in vitro, поскольку позволяет исследовать механизм, влияющий на раннюю васкуляризацию и процесс потери фолликулов. Этот метод недорог и может быть выполнен без какого-либо риска отторжения трансплантата из-за естественного иммунодефицита эмбриона в течение первых 17 дней. Более того, такой подход не вызывает никаких этических или правовых проблем с точки зрения европейского права.
Наилучшая стратегия развития мануальных навыков, необходимых для манипуляций с яйцеклетками, может быть достигнута путем тренировки с неэмбриональными яйцеклетками перед самим экспериментом. Для начала пометьте маркером нулевые яйца, полученные от отобранных в Лувене птенцов породы белый леггорн. Инкубируйте яйца в инкубаторе, установленном при температуре 37 градусов по Цельсию, заостренными концами вниз.
Поворачивайте яйца на 180 градусов два-три раза в день вручную. В темноте приложите яичную свечу к яичной скорлупе и отметьте маркером центр воздушного кармана на яичной скорлупе. Включите свет и поверните стерильный прямой штифт в отмеченном положении, чтобы сделать отверстие около одного миллиметра.
Найдите желточный мешок в темноте с помощью свечи для яиц. Проколите яйцо стерильной иглой 19 калибра, расположенной под углом 45 градусов ко дну яйца, не нарушая желточный мешок. Аспирируйте от 1,5 до двух миллилитров альбумина, чтобы отделить CAM от оболочки.
Затем закройте отверстие скотчем. Включите свет и нарисуйте на горизонтально расположенном яйце прямоугольное окошко размером один на 1,5 сантиметра. Держите яйцо в одной руке и аккуратно вырежьте окошко в скорлупе с помощью полотна спиральной пилы, не треснув скорлупу.
Регулярно дуйте, чтобы удалить пыль и мусор из скорлупы. Проденьте стерильные щипцы под прямоугольный кусок оболочки и аккуратно извлеките его, не повредив CAM. Затем отбросьте белую внешнюю оболочку, чтобы увидеть эмбрион и CAM.
В жизнеспособных эмбриональных яйцеклетках прозрачный альбумин, сосудистое кольцо вокруг эмбриона, а иногда и бьющееся сердце, наблюдаются на третий день развития куриного эмбриона. Под колпаком ламинарного потока поместите яйцо на решетку для яиц окном вверх и снимите ленту. Аккуратно поместите и немедленно удалите на эпителиальную поверхность односантиметровую квадратную полоску стерильной бумаги для линз, извлеченной из эфира, чтобы травмировать небольшой участок CAM.
Затем возьмите одну замороженную размороженную полоску кортикального слоя яичника микрохирургическими щипцами и поместите ее на травмированный КАМ медуллярной стороной к КАМ. Оцените трансплантат макроскопически и обратите особое внимание на сосудистую реакцию КАМ на трансплантат, прежде чем делать цифровые фотографии или видео. После этого соберите трансплантат, захватив ткань или окружающий КАМ щипцами и осторожно удалив трансплантат из КАМ с помощью ножниц.
Трансплантаты оказались жизнеспособными в 100% случаев после первого дня прививки. Они уже были частично прикреплены к CAM, и показывали рисунок спиц кровеносных сосудов, необходимых для их васкуляризации. После шести дней пересадки имплантаты были приклеены к CAM.
Примерно на третий день после трансплантации трансплантаты были покрыты вторым слоем CAM и инкапсулированы. Трансплантат показал хорошую васкуляризацию, 80% трансплантатов проникли в яйцеклетку. Два трансплантата не прикрепились к КАМ и приобрели некротический вид, в результате чего приживаемость трансплантированной ткани составила 83% через шесть дней.
При гистологическом исследовании трансплантата здоровые фолликулы наблюдались во все временные точки. После трансплантации наблюдалось незначительное снижение плотности фолликулов. Выживаемость фолликулов поддерживалась на уровне 95% в первый день и 83% в шестой день.
Самая сложная часть - сделать небольшое отверстие, необходимое для аспирации альбумина, чтобы отделить CAM от яичной скорлупы, прежде чем создать окно для нанесения. Слишком сильное давление может привести к чрезмерной стимуляции или даже может привести к растрескиванию и разрушению яйцеклетки, что приведет к необратимому повреждению CAM или ее сосудистой сети. Эта модель идеально подходит для тестирования нескольких аспектов раннего периода после трансплантации ткани яичника, включая влияние проангиогенных факторов, защитных антиоксидантов, цитокинов, гормонов и других факторов, контролирующих активацию фолликулов и ранний рост.
Эта модель показала связь между ранней васкуляризацией и модуляцией активации фолликулов, которые являются двумя основными событиями, приводящими к снижению овариального резерва после трансплантации ткани яичника.
