L'uso della CAM per osservare i cambiamenti precoci dopo il trapianto di tessuto ovarico ha un vantaggio significativo rispetto ai modelli in vitro, poiché consente di studiare i meccanismi che influenzano il processo di vascolarizzazione precoce e di perdita del follicolo. Questa tecnica è poco costosa e può essere eseguita senza alcun rischio di rigetto dell'innesto a causa dell'immunodeficienza naturale dell'embrione per i primi 17 giorni. Inoltre, questo approccio non solleva preoccupazioni etiche o giuridiche in termini di diritto europeo.
La migliore strategia per sviluppare le abilità manuali necessarie per la manipolazione degli ovuli può essere raggiunta attraverso l'allenamento con ovuli non embrionati prima dell'esperimento vero e proprio. Per iniziare, etichettare le uova del giorno zero ricevute da pulcini livornesi bianchi selezionati da Lovanio utilizzando un pennarello. Incubare le uova in un'incubatrice posta a 37 gradi Celsius, con le estremità appuntite rivolte verso il basso.
Ruota le uova di 180 gradi, due o tre volte al giorno manualmente. Al buio, posiziona una candela a uovo contro il guscio d'uovo e individua il centro della sacca d'aria sul guscio d'uovo usando un pennarello. Accendi le luci e ruota un perno dritto sterile nella posizione contrassegnata per creare un'apertura di circa un millimetro.
Individua il sacco di tuorlo al buio usando il candelabro per uova. Perforare l'uovo con un ago sterile calibro 19, inclinato di 45 gradi verso il fondo dell'uovo, senza rompere il sacco vitellino. Aspirare da 1,5 a due millilitri di albumina per staccare il CAM dal guscio.
Quindi chiudere il foro con del nastro adesivo. Accendi le luci e disegna una finestra rettangolare di uno per 1,5 centimetri sull'uovo posizionato orizzontalmente. Tieni l'uovo in una mano e taglia delicatamente una finestra nel guscio dell'uovo, usando una lama per sega a traforo, senza rompere il guscio.
Soffiare regolarmente per rimuovere polvere e detriti del guscio. Far scorrere la pinza sterile sotto il pezzo rettangolare di guscio e rimuoverlo in modo pulito senza danneggiare il CAM. Quindi scartare la membrana esterna bianca per vedere l'embrione e la CAM.
Negli ovuli embrionati vitali, l'albumina chiara, un anello vascolare attorno all'embrione e, talvolta, un cuore pulsante, si osservano il terzo giorno di sviluppo dell'embrione di pulcino. Sotto la cappa a flusso laminare, posizionare l'uovo sulla griglia con la finestra rivolta verso l'alto e staccare il nastro. Posizionare delicatamente e rimuovere immediatamente una striscia quadrata di un centimetro di carta sterile per lenti estratta con etere sulla superficie epiteliale, per traumatizzare una piccola area della CAM.
Quindi afferrare una striscia corticale ovarica congelata e scongelata con una pinza microchirurgica e posizionarla sulla CAM traumatizzata con il lato midollare contro la CAM. Valutare l'innesto macroscopicamente e prestare particolare attenzione alla reazione vascolare del CAM nei confronti dell'innesto prima di acquisire fotografie o video digitali. Una volta terminato, prelevare l'innesto afferrando il tessuto o il CAM circostante con una pinza e asportando con cura l'innesto dal CAM usando le forbici.
Gli innesti sono risultati vitali nel 100% dei casi dopo il primo giorno dell'innesto. Erano già parzialmente aderenti alla CAM e mostravano il modello dei raggi della ruota dei vasi sanguigni necessari per la loro vascolarizzazione. Dopo sei giorni di innesto, gli impianti sono stati fatti aderire al CAM.
Intorno al terzo giorno dopo il trapianto, gli innesti sono stati ricoperti con un secondo strato di CAM e sono stati incapsulati. L'innesto ha mostrato una buona vascolarizzazione, con l'80% dei trapianti che sono penetrati nell'ovulo. Due innesti non si sono attaccati alla CAM e hanno assunto un aspetto necrotico, con un tasso di sopravvivenza del tessuto innestato dell'83% dopo sei giorni.
Nella valutazione istologica del trapianto, sono stati osservati follicoli sani in tutti i punti temporali. Dopo il trapianto, è stata osservata una diminuzione insignificante della densità dei follicoli. I tassi di sopravvivenza del follicolo sono stati mantenuti durante il periodo di innesto al 95% il primo giorno e all'83% il sesto giorno.
La parte più impegnativa è fare il piccolo foro necessario per aspirare l'albumina, per staccare il CAM dal guscio d'uovo, prima di creare una finestra di applicazione. Troppa pressione può provocare una sovrastimolazione, o può addirittura rompere e distruggere l'ovulo, causando danni irreversibili alla CAM o alla sua vascolarizzazione. Questo modello è ideale per testare diversi aspetti del tessuto ovarico precoce dopo l'innesto, tra cui l'impatto di fattori pro-angiogenici, agenti antiossidanti protettivi, citochine, ormoni e altri fattori che controllano l'attivazione del follicolo e la crescita precoce.
Questo modello ha indicato il legame tra la vascolarizzazione precoce e la modulazione dell'attivazione follicolare, che sono i due eventi principali che determinano il declino della riserva ovarica dopo il trapianto di tessuto ovarico.
