Die Verwendung von CAM zur Beobachtung früher Veränderungen nach einer Transplantation von Eierstockgewebe hat einen erheblichen Vorteil gegenüber In-vitro-Modellen, da sie die Untersuchung von Mechanismen ermöglicht, die den Prozess der frühen Vaskularisierung und des Follikelverlusts beeinflussen. Diese Technik ist kostengünstig und kann in den ersten 17 Tagen ohne das Risiko einer Transplantatabstoßung aufgrund des natürlichen Immundefekts des Embryos durchgeführt werden. Darüber hinaus wirft dieser Ansatz keine ethischen oder rechtlichen Bedenken im Hinblick auf das europäische Recht auf.
Die beste Strategie, um die manuellen Fähigkeiten zu entwickeln, die für die Manipulation von Eizellen erforderlich sind, kann durch das Training mit nicht-embryonierten Eizellen vor dem eigentlichen Experiment erreicht werden. Zu Beginn beschriften Sie die Eier des Tages Null, die Sie von Löwen-ausgewählten weißen Leghornküken erhalten haben, mit einem Marker. Bebrüten Sie die Eier in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator, wobei die spitzen Enden nach unten zeigen.
Drehen Sie die Eier zwei- bis dreimal täglich manuell um 180 Grad. Stellen Sie im Dunkeln eine Eierkerze an die Eierschale und markieren Sie die Mitte der Lufttasche auf der Eierschale mit einem Filzstift. Schalten Sie das Licht ein und drehen Sie einen sterilen geraden Stift an der markierten Stelle, um eine Öffnung von etwa einem Millimeter zu machen.
Finde den Dottersack im Dunkeln mit dem Eierkerl. Stechen Sie das Ei mit einer sterilen 19-Gauge-Nadel ein, die in einem Winkel von 45 Grad zum Boden des Eies geneigt ist, ohne den Dottersack zu beschädigen. Saugen Sie 1,5 bis zwei Milliliter des Albumins an, um das CAM von der Hülle zu lösen.
Anschließend das Loch mit Klebeband verschließen. Schalten Sie das Licht ein und zeichnen Sie ein rechteckiges Fenster von einem mal 1,5 Zentimeter auf das horizontal platzierte Ei. Halten Sie das Ei in einer Hand und schneiden Sie mit einem Dekupiersägeblatt vorsichtig ein Fenster in die Eierschale, ohne die Schale zu zerbrechen.
Blasen Sie regelmäßig, um Schalenstaub und Schmutz zu entfernen. Schieben Sie die sterile Pinzette unter das rechteckige Stück Schale und entfernen Sie es sauber, ohne das CAM zu beschädigen. Werfen Sie dann die weiße äußere Schalenmembran ab, um den Embryo und das CAM zu sehen.
In lebensfähigen embryonierten Eiern sind am dritten Tag der Embryonalentwicklung des Kükens klares Albumin, ein Gefäßring um den Embryo und manchmal ein schlagendes Herz zu sehen. Legen Sie das Ei unter der Laminar-Flow-Haube mit dem Fenster nach oben auf den Eierrost und ziehen Sie das Klebeband ab. Legen Sie vorsichtig einen einen Zentimeter quadratischen Streifen steriles, etherextrahiertes Linsenpapier auf die Epitheloberfläche und entfernen Sie ihn sofort, um einen kleinen Bereich des CAM zu traumatisieren.
Fassen Sie dann einen gefrorenen, aufgetauten kortikalen Streifen der Eierstöcke mit einer mikrochirurgischen Zange und legen Sie ihn mit der medullären Seite gegen das CAM auf das traumatisierte CAM. Beurteilen Sie das Transplantat makroskopisch und achten Sie besonders auf die vaskuläre Reaktion des CAM auf das Transplantat, bevor Sie digitale Fotos oder Videos aufnehmen. Wenn Sie fertig sind, entnehmen Sie das Transplantat, indem Sie das Gewebe oder die umgebende CAM mit einer Zange fassen und das Transplantat vorsichtig mit einer Schere aus dem CAM herausschneiden.
Die Transplantate waren in 100% der Fälle nach dem ersten Tag der Transplantation lebensfähig. Sie waren bereits teilweise am CAM anhaftend und zeigten das Radspeichenmuster der Blutgefäße, die für ihre Vaskularisierung benötigt werden. Nach sechs Tagen der Transplantation wurden die Implantate auf das CAM geklebt.
Etwa am dritten Tag nach der Transplantation wurden die Transplantate mit einer zweiten Schicht CAM bedeckt und verkapselt. Das Transplantat zeigte eine gute Vaskularisation, wobei 80% der Transplantate in die Eizelle eindrangen. Zwei Transplantate hefteten sich nicht an das CAM und nahmen ein nekrotisches Aussehen an, was zu einer Überlebensrate des transplantierten Gewebes von 83 % nach sechs Tagen führte.
Bei der histologischen Auswertung des Transplantats wurden zu allen Zeitpunkten gesunde Follikel beobachtet. Nach der Transplantation wurde eine unbedeutende Abnahme der Follikeldichten beobachtet. Die Überlebensraten der Follikel wurden während der Transplantationsphase am ersten Tag bei 95 % und am sechsten Tag bei 83 % gehalten.
Die größte Herausforderung besteht darin, das kleine Loch zu bohren, das zum Absaugen des Albumins erforderlich ist, um das CAM von der Eierschale zu lösen, bevor ein Fenster zum Auftragen erstellt wird. Zu viel Druck kann zu einer Überstimulation führen oder sogar die Eizelle zerbrechen und zerstören, was zu einer unwiderruflichen Schädigung des CAM oder seines Gefäßsystems führen kann. Dieses Modell ist ideal, um verschiedene Aspekte der frühen Phase des Eierstockgewebes nach der Transplantation zu testen, einschließlich der Auswirkungen von pro-angiogenetischen Faktoren, schützenden antioxidativen Wirkstoffen, Zytokinen, Hormonen und anderen Faktoren, die die Follikelaktivierung und das frühe Wachstum steuern.
Dieses Modell zeigte den Zusammenhang zwischen der frühen Vaskularisierung und der Modulation der Follikelaktivierung, den beiden Hauptereignissen, die zu einer Abnahme der ovariellen Reserve nach einer Transplantation von Eierstockgewebe führen.
