Продемонстрированный протокол диссоциации ткани поджелудочной железы прост и предоставляет инструмент для выделения жизнеспособных единичных клеток из ткани поджелудочной железы на разных стадиях процесса злокачественного новообразования, включая солидные опухоли. Восстановление интактных и жизнеспособных ацинарных клеток является серьезной проблемой. Протокол может восстановить жизнеспособные одиночные клетки из нормальной поджелудочной железы, поджелудочной железы с предраковыми поражениями или опухолей поджелудочной железы, содержащих многочисленные стромальные и иммунные клетки.
Использование этого протокола для вскрытия опухолей поджелудочной железы человека или воспаленной поджелудочной железы может помочь в исследовании этих заболеваний для поиска новых биомаркеров и методов лечения. Метод прост в использовании и может обеспечить желаемые результаты при минимальной практике. Это видео поможет рассмотреть мелкие детали протокола.
Перед началом вскрытия держите все инструменты и оборудование наготове на льду. После фиксации усыпленной мыши опрыскайте ее брюшко 70%-ным этанолом. С помощью ножниц и щипцов сделайте V-образный разрез в 2,5 сантиметра в области половых органов животного, и приступайте к движению вверх, чтобы полностью раскрыть брюшную полость.
Расположите желудок с левой стороны мыши и поджелудочную железу, которая находится рядом с селезенкой. С помощью двух щипцов отделите поджелудочную железу от желудка и двенадцатиперстной кишки без разрыва. Продолжайте и отделяйте поджелудочную железу от тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки.
Переместите поджелудочную железу в правую сторону и отделите щипцами оставшиеся соединения между поджелудочной железой и грудной полостью, чтобы полностью отделить поджелудочную железу и прикрепленную селезенку. Осторожно удалите поджелудочную железу без брыжеечного жира или других прилегающих тканей, и разложите ее для исследования в чашке Петри на льду. Следуя указанному в тексте составу, заранее приготовьте диссоциационные буферы 1 и 2, промывите буфер и раствор остановки активности фермента.
Поместите поджелудочную железу в 50-миллилитровую пробирку на лед и промойте ее 10%-ной фетальной бычьей сывороткой, или FBS, и сбалансированным солевым раствором Хэнка, или HBSS. Жир всплывет, а поджелудочная железа утонет. Это простой способ визуализировать и быстро удалить загрязняющую белую жировую ткань, все еще прикрепленную к поджелудочной железе.
Затем перенесите и храните ткань поджелудочной железы мыши в стерильной чашке Петри, содержащей пять миллилитров HBSS, на льду до нарезки. С помощью ножниц Нойеса и скальпеля разрежьте поджелудочную железу на небольшие кусочки от одного до трех кубических миллиметров. После переноса тканей в центрифужную пробирку центрифугируйте ее при температуре 350G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость для удаления фрагментов клеток и клеток крови. Повторно суспендируйте кусочки в диссоциационном буфере 1, содержащем 0,02% трипсина-С и 0,05% ЭДТА, в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия при перемешивании. Немедленно промойте 10%-ным FBS и Dulbecco Modified Eagle's Medium, или DMEM, и центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 350 г и четырех градусах Цельсия.
Промойте еще раз, повторно суспендировав гранулу в 10 миллилитрах буфера для промывки и центрифугировав, как и раньше, в течение пяти минут перед следующим этапом диссоциации. Инкубируют поджелудочную железу в диссоциационном буфере 2 в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия при перемешивании со скоростью 180 оборотов в минуту. Через 15 минут проводят механическую диссоциацию, энергично пипетируя фрагменты поджелудочной железы вверх и вниз 10 раз с помощью стерильных серологических пипеток.
Повторите процедуру, используя пипетки уменьшающегося размера, начиная с 25, 10 и заканчивая 5 миллилитрами. Инкубируйте образец, чтобы довести его до 37 градусов по Цельсию. Используйте световую микроскопию, чтобы контролировать диссоциацию в зависимости от количества одиночных клеток в суспензии.
Контролируйте жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего. Продолжайте инкубацию и проверяйте диссоциацию, отбирая пробы каждые пять минут. Инкубируют до тех пор, пока 90% клеток не будут разделены на отдельные ячейки.
После того, как ткань поджелудочной железы хорошо диссоциирует, о чем свидетельствует исчезновение фрагментов поджелудочной железы и нарастающая мутность раствора, остановите ферментативную реакцию путем промывания раствора дважды с активностью фермента в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия. С этого шага держите клеточную суспензию на льду. Пропустите клеточную суспензию через нейлоновую сетку толщиной 70 микрон.
Меньший размер нейлоновой ячейки может снизить жизнеспособность клеток. Проверьте жизнеспособность клетки под микроскопом. Ресуспендируйте и промойте гранулу 5-10 миллилитрами ледяного буферного промывочного раствора перед подсчетом клеток.
Если наблюдается несколько эритроцитов, обработайте клетки буфером для лизиса эритроцитов в течение двух минут при комнатной температуре. В тех случаях, когда наблюдаются скопления, образцы следует повторно обработать трипсином, как описано выше. Если жизнеспособность составляет менее 80%, живые клетки должны быть изолированы с помощью магнитно-активированной сортировки клеток или набора для удаления мертвых клеток MACS с колонками MACS MS.
Красный цвет выделенной ткани поджелудочной железы обусловлен экспрессией tdTomato в ацинарных клетках. На ранней стадии диссоциации наблюдалось малое количество изолированных клеток и большое количество скоплений. В дальнейшем были получены изолированные жизнеспособные клетки, избегая при этом уменьшения количества жизнеспособных клеток.
Более длительная инкубация снижала жизнеспособность клеток. Положительные клетки tdTomato оценивали с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки. Протокол мягкой диссоциации поддерживал восстановление нескольких типов клеток с высокой жизнеспособностью, что позволяло проводить последующую сортировку нужных типов клеток.
Подсчет живых клеток до мертвых клеток проводили с помощью гемацитометра. Флуоресцентные изображения замороженных срезов поджелудочной железы показали ацинарные клетки tdTomato. Секвенирование РНК одной клетки подтвердило обнаружение всех типов клеток, обнаруженных при флуоресцентно-активированной сортировке клеток в каждой резецированной ткани со всех временных точек.
Изучена экспрессия карбоксипептидазы1, или CPA1 в ацинарных клетках, что указывает на минимальную контаминацию транскриптомом других типов клеток. Важно отметить, что более длительное время инкубации снижает жизнеспособность клеток, поэтому важно контролировать образец и наблюдать за диссоциацией ткани и жизнеспособностью клеток каждые несколько минут под микроскопом. Протокол выделения клеток может быть использован для секвенирования РНК одиночных клеток, культивирования клеток или в качестве исходного материала для органоидов.
Этот метод позволяет изучить, как развивается рак поджелудочной железы, и исследовать взаимодействие между клетками, которые инфильтрируют воспаленную или раковую ткань.
