Целью данного исследования является углубление нашего понимания роли сосудистой сети поджелудочной железы как в нормальной биологии поджелудочной железы, так и в развитии заболевания. Успешно обогащая эндотелиальную фракцию, мы стремимся идентифицировать специфические пути в сосудистой сети, которые управляют функциями поджелудочной железы, которые потенциально могут быть направлены на восстановление и усиление функций поджелудочной железы в условиях заболевания. В последнее время все больший акцент делается на роли дисфункции эндотелиальных клеток при патологиях поджелудочной железы.
Идентификация гетерогенности популяций эндотелиальных клеток в поджелудочной железе позволила понять, как взаимодействие эндотелиальной поджелудочной железы способствует или защищает от заболеваний. Омиксные подходы, такие как секвенирование РНК одной клетки или одного ядра, протеомика и геномика, используются для изучения поджелудочной железы на клеточном уровне. Для получения информации на тканевом или пространственном уровне внедряются новые платформы, использующие непредвзятые и основанные на зондах подходы, такие как Visium и Xenium.
В этом протоколе мы описываем метод щадящей диссоциации, который сводит к минимуму эндогенные ферменты поджелудочной железы от снижения жизнеспособности клеток, и процедуру магнитной сортировки клеток для селективного обогащения эндотелиальных клеток. Стратегия диссоциации и обогащения нашего протокола позволит лучше понять как маркеры клеточной поверхности, так и транскриптом эндотелиальных клеток поджелудочной железы, который ранее был недостаточно изучен из-за технических ограничений. Для начала расположите усыпленную мышь на операционном столе.
Вытяните конечности мыши и закрепите их булавками. С помощью хирургических ножниц сделайте небольшой разрез по средней линии через кожу и брюшину от нижней части живота и протяните в сторону грудного отдела. Разрежьте диафрагму и поднимите грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
Введите иглу 25-30 калибра, соединенную со шприцем, содержащим ледяной стерильный PBS, в левый желудочек сердца. Перфугируйте сердце со скоростью от пяти до 10 миллилитров в минуту и прекратите после инъекции 10 миллилитров. Затем с помощью препарирующих ножниц и щипцов осторожно извлеките поджелудочную железу.
Переложите поджелудочную железу в 50-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров ледяного PBS, вместе с ингибитором трипсина, и поместите трубку на лед. Для начала приобретите мышиную поджелудочную железу в чашке Петри, содержащей ледяной PBS. С помощью хирургических ножниц и пинцета аккуратно удалите лишнюю ткань.
Перенесите обрезанную поджелудочную железу в пятимиллилитровую трубку, содержащую один миллилитр диссоциационного раствора. Ножницами для препарирования измельчите ткани поджелудочной железы на мелкие кусочки, держа трубку на льду. Переложите лизат в 50-миллилитровую пробирку, помещенную на лед.
Добавьте два миллилитра раствора коллагеназы в пятимиллилитровую трубку, чтобы удалить остатки панкреатической ткани, и перенесите ее в 50-миллилитровую трубку. Выдержите трубку на водяной бане, температурной до 37 градусов Цельсия, в течение 20 минут. Поместите трубку с тканью-гомогенатом на лед и дайте ей осесть под действием силы тяжести.
Затем пропустите надосадочную жидкость через фильтр 70 микрометров и добавьте пять миллилитров раствора для остановки диссоциации. С помощью иглы 27 калибра разотрите оставшуюся гранулу с дополнительным одним миллилитром диссоциационного раствора и пропустите ее через фильтр, как и раньше. Вращайте клеточную суспензию при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре промывочного буфера.
Инкубировать один раз по 10 в степени семи клеток с одним микролитром анти-CD31 биотинового антитела на ротаторе. Добавьте 20 микролитров антибиотиновых микрогранул и инкубируйте еще 40 минут. Затем установите магнитную стойку с держателем сепаратора колонн и нанесите колонку.
После уравновешивания колонки добавьте в нее образец и промойте в общей сложности девятью миллилитрами буфера для промывки. Извлеките колонку из держателя и поместите ее в трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте в колонку пять миллилитров буфера для промывки.
С помощью поршня надавите на клетки в колонке, чтобы собрать элюирование, содержащее эндотелиальные клетки. Наконец, уменьшите проточную и элюирующую фракции. После повторной проверки подсчитайте клетки и измерьте жизнеспособность.
Количественный ПЦР-анализ для подтверждения обогащения эндотелиальных клеток показал, что обогащенные фракции имели значительно более высокие уровни маркерных генов, Pecam1 и Kdr по сравнению с проточными образцами. Более низкий уровень гомеобокса 1 NK6, транскрипционного фактора в эндокринных клетках поджелудочной железы, наблюдался в обогащенных фракциях. Вестерн-блоттинг показал сильные сигналы CD31 при ожидаемом размере, что еще раз подтверждает обогащение эндотелиальных клеток во фракциях.
