Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать развитие нейросфер из смешанных первичных гиппокампа и корковых нейронов, изолированных от эмбриона крысы E14-E16 Sprague Dawley, с тем чтобы предложить надежную и недорогой платформу для изучения эффекта различных нейротерапевтических приводит. Как вы знаете, этот мозг является сложной сетью нейронов, связанных с большим количеством поддерживающих клеток. Чтобы понять функцию мозга, часто большая часть исследований вновь инициируется из экспериментов in vitro, которая включает в себя коммерчески доступные нейронные линии производных клеточных линий.
Тем не менее, это клеточные линии преобразованы клеточные линии, которые страдают от генотипических и фенотипических вариаций. Для решения этой проблемы, первичной культуры нейронов является подходящим подходом. Здесь мы проиллюстрировали простой и экономически эффективный протокол для культуры первичных нейронов и создали надежную платформу скрининга для различных нейронных терапевтических средств.
Основным преимуществом этого протокола является то, что, просто модулируя плотность покрытия клеток, мы можем продемонстрировать две контрастные платформы культуры нейронов, где низкая плотность приводит к длительной культуре первичных нейронов, а высокая плотность генерирует спонтанные нейросферы. Возьмите две пластины из 24 колодец. Один для высокой плотности, а другой для покрытия низкой плотности.
Передача 12 мм стерильных стеклянных крышек в 24-хорошо пластин. Налейте 300 микролитров раствора PDL в каждой из скважин таким образом, чтобы она полностью покрывает поверхность всей крышки. Приготовьте раствор PDL при концентрации 0,1 мг/мл в деионизированной воде.
Оберните пластины алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить высыхание, и держать его в инкубаторе CO2 на ночь. На следующий день, перед покрытием, аспирировать решение PDL. Вымойте правильно стерильной водой в течение двух-трех раз.
Затем добавьте покрытие мультимедиа и верните пластины в инкубатор до покрытия. Пожертвовать E14-E16 время беременности Sprague-Dawley крысы, Сделать V-образный разрез в брюшной области с помощью стерильных типсов и пару тупых ножниц. Удалите все плоды и аккуратно поместите их на пластину Петри с холодным раствором HBSS.
Вынюйте эмбрионы из эмбриональных мешков и тщательно вымойте их в отдельной чашке Петри в свежем, холодном HBSS. Обезглавить голову с помощью стерильных ножниц. Перенесите головки в стерильные 90 мм плиты Петри с холодным HBSS.
Под стерео микроскопом держите голову от области морды стерильными зубчатыми типсами и вынюхив мозг, разрезая кожу и череп открытым. Удалите все околивания из полушарий и среднего мозга, удерживая ствол мозга. Аккуратно удалите нетронутые полушария, напоминающие грибные шапки, которые содержат гиппокамп и кору.
Соберите полушария, содержащие кору и нетронутый гиппокамп в конической трубке 15 мл, содержащей 10 мл диссоциации. Разрешить собранные ткани, чтобы успокоиться, и аспирировать диссоциации среды, оставляя пять-десять процентов среды в нем. Опять же, добавить 10 мл свежей среды диссоциации к нему, и повторить этот шаг в два раза.
Добавьте 4,5 мл средства диссоциации и 0,5 мл раствора трипсин-ЭДТА. Держите его в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут для пищеварения, чтобы продолжить. Аспирировать средний и мыть с 10 мл диссоциации среды и покрытие среды, последовательно.
Повторное их в 2,5 мл покрытия среды. Храните 90 мм стерильную тарелку над перевернутой крышкой блюда и вылейте ее в основание 90 мм стерильной тарелки. Титрат переваренных тканей в углу основания блюдо, используя 1000 микролитер пипетки наконечник, с тем чтобы занять наименьшее количество.
Перейдите полученную клеточную суспензию через 70-метровый клеточный ситечко, исключая любые куски ткани. Определите плотность жизнеспособных клеток с помощью исключения трипана синего красителя и подсчитайте количество ячеек в автоматизированном счетчике клеток. Разбавить количество клеток, полученных таким образом, чтобы пластины 1,5 в 10 к власти 5 клеток на мл для высокой плотности покрытия, и 20000 клеток на мл для низкой плотности покрытие в двух отдельных труб, содержащих 30 мл покрытия среды.
Аспирировать ранее добавленное покрытие среды и пластины 500 микролитров клеток, рассеянных в покрытие среды в каждой хорошо. После этого верните пластины в инкубатор на четыре часа. Через четыре часа после покрытия, изучить клетки для присоединения под микроскопом.
После четырех часов покрытия, как в высокой, так и низкой плотности пластин, нейроны показывают хорошую приверженность пластин. Замените среду в каждой хорошо с 500 микролитров свежей среды обслуживания, и инкубировать его в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию. Мы должны культури эти нейроны покрытием для при высокой и низкой плотности.
В то время как с покрытием нейронов низкой плотности могут быть использованы для длительных культур, до 30 дней, путем изменения обслуживания среды два раза в неделю, высокой плотности покрытием нейронов начинает спонтанно генерировать нейросферы, которые пришли на следующий день после того, как мы поддерживали в ультра-низкой пластины вложения. После 24 часов покрытия, как с высокой, так и низкой плотностью потроха нейронов наблюдается для отображения здоровой морфологии. Здесь отображается фазовое контрастное изображение нейронов с низкой плотностью, которые культурируются около семи дней.
Нейроны отображают здоровую морфологию, и могут поддерживаться до 30 дней с более энергичной маршрутизации и взаимосвязей. Диаграмма бара показывает около 90 процентов жизнеспособности нейронов с низкой плотностью даже после 30 дней культуры, как это определено анализом MTT. Первичные нейроны здесь были охарактеризованы иммуностимулирования с Tuj 1, маркер дифференцированных нейронов, и тау, маркер нейрональных аксонов.
Чистота нейронов подтверждается отсутствием окрашивания в не нейрональных маркерах GFAP для астроцитов и O4 для олигодендроцитов. Во всех исследованиях характеристик, ядра были окрашены Hoechst 33258. Здесь, низкой плотности семян клетки были окрашены астроцитическим маркером GFAP и нейрональный маркер Tuj 1, чтобы проверить чистоту культуры до семи дней.
Отмечается, что данный протокол поддерживает преференциальный рост нейронов над астроцитами, как указано в количественном анализе. Ядра были запятнаны Hoechst 33258. Аналогичным образом, в высокой плотности семенных клеток, астроциты были окрашены GFAP и нейронов Tuj 1.
Здесь, в количественном анализе, около 17 процентов астроцитов наблюдаются по сравнению с 83 процентов нейронов. Ядра были окрашены Hoechst 33258. Через семь дней наблюдается спонтанное образовалось несколько нейросфер в нейронах высокой плотности.
Примерно на восьмой-десятый день культуры, в нейронах с высокой плотностью, нейросферы начинают формировать большие проекции и мосты, состоящие из радиальных глиальных расширений. Черные стрелы указывают на мост между двумя вновь образованными нейросферами. Анализ живых и мертвых клеток проводился в нейросферах в течение 15 дней.
В плотном Calcein AM окрашивание, без абсолютно никакого окрашивания йодида пропидия, указывает на почти 100-процентную жизнеспособность нейросфер в культуре. График линии здесь указывает на расширение размера нейросфер с прохождением количества дней. Это чрезмерно окрашенные изображения нейросферы указывает на богатую популяцию нейронных клеток-предшественников за счет увеличения экспрессии маркеров NPC Nestin и Tuj 1.
Нейросферы здесь показывают большое количество астроцитов, отмеченных сильным выражением GFAP, сопровождается еще более высоким выражением нейронального маркера Tuj 1. Ядра были окрашены Hoechst 33258. Так что я думаю, что наш протокол довольно захватывающий и интересный, учитывая тот факт, что из одной стратегии мы можем получить две платформы: одну 2-D и одну 3-D.
И это будет отличная платформа для скрининга различных нейротерапевтических треков. Так что я думаю, это действительно очень полезно для всех нейробиологов. Также еще одним важным аспектом является то, что нейросферы мы выбираем в чрезвычайно богаты нейронных клеток-предшественников, NPC.
И они могут быть использованы, чтобы дифференцировать их на нейроны и не нейрональные линии. Так что, я чувствую, если, действительно, люди могут освоить эту технику, принимая помощь от этого видео, это будет действительно очень полезно для всех. Спасибо.
