Анализ волокон ДНК позволяет понять, как наноматериалы влияют на ДНК на одномолекулярном уровне. И эта информация позволит разработать стратегии, которые позволят снизить нанотоксичность. Этот метод позволяет нам понять динамику ДНК и то, как на нее влияют, когда клетки или ткани подвергаются воздействию повреждающих ДНК агентов, экзогенных или эндогенных, и мы можем посмотреть на репликацию ДНК, репарацию ДНК и динамику хроматина.
Что мы действительно хотим, чтобы люди знали об этой технике, так это то, что это разные вещи, которые мы можем сделать или один человек. Один из них заключается в том, чтобы понять, как новые химиотерапевтические агенты могут повлиять на здоровье клетки, чтобы увидеть, сможете ли вы убить их быстрее или эффективнее. Следующее, что нужно сделать, это подумать о том, что когда вы добавляете агент, скажем, это новый терапевтический или фармацевтический агент, вы хотите знать, навредит ли он человеку, прежде чем вы дадите его ему.
Таким образом, вы можете просто дать агент клеткам или модельным системам и посмотреть, повредит ли он клеткам или модельной системе, и если да, то насколько? Следующее, что нужно сделать, это посмотреть, что мы разрабатываем все эти новые нанолекарства, и мы хотим убедиться, что эти нанолекарства не наносят вреда человеку или месту, где мы вводим нанолекарства. Последнее, что иногда вы хотите знать, как белок влияет на репликацию ДНК, репарацию ДНК или динамику хроматина, и мы можем использовать эту технику, чтобы сделать это.
Это Ширали Патель, студентка магистратуры в области медицинской биотехнологии в моей лаборатории, которая продемонстрирует процедуру. Начните подготовку к анализу волокна с удаления среды из 75-80% сливающихся клеток макрофагов RAW 264,5 и разделите ее на две половины. Зарезервируйте одну половину для импульса хлор-йоддезоксиуридина или резерва хлорйодоксиуридина и добавьте пять микролитров йоддезоксиуридина к другой половине, получая 50 микромолей в качестве конечной концентрации.
После смешивания добавьте йоддезоксиуридинсодержащую среду обратно в планшеты и поместите клетки в инкубатор на 20 минут. Предварительно подогрейте резервную среду хлор-йододезоксиуридина при 37 градусах Цельсия и добавьте в эту среду хлорйодоксиуридин до импульса хлорйодоксиуридина. Через 20 минут аспирируйте среднюю смесь йоддезоксиуридина из колбы с клетками макрофагов RAW 264.5.
Аккуратно промойте ячейки 500 микролитрами PBS с pH 7,4 и поверните пластину, прежде чем выбросить PBS. Обработайте клетки различными концентрациями наночастиц оксида графена в 500 микролитрах среды и инкубируйте в течение 30 минут. После инкубации аспирируйте смесь лечебной среды и осторожно промойте клетки 500 микролитрами PBS, осторожно вращая пластину, прежде чем выбросить PBS.
Затем добавьте пять микролитров хлорйодоксиуридина в резервную среду хлор-йододезоксиуридина и покройте клетки резервной средой хлор-йоддезоксиуридина. Для импульса хлорйодоксиуридина поместите клетки в инкубатор на 20 минут. После промывки PBS соскребите ячейки в течение трех-четырех минут, затем добавьте в тарелку пять миллилитров среды и соберите ячейки.
Центрифугируйте собранные клетки при 264G в течение четырех минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре ледяного PBS. Чтобы подготовить волокна ДНК, пометьте предметные стекла с условиями эксперимента и датой с помощью карандаша.
Аспирируйте два микролитра клеток в пипетку и держите пипетку под углом примерно 45 градусов. Затем поместите пипетку примерно на один сантиметр ниже скользящей метки и переместите пипетку горизонтально к скользящей метке с медленным высвобождением клеточного раствора. Как только раствор испарится и станет липким и липким, наложите на каждую линию клеток 15 микролитров буфера для лизиса, не позволяя кончику пипетки касаться предметного стекла.
Затем наклоните слайд под углом 25 градусов и дайте ДНК высохнуть на воздухе в течение как минимум четырех часов. В первый день зафиксируйте волокна ДНК, погрузив предметные стекла в метанольную уксусную кислоту на две минуты. На второй день поместите предметные стекла в стеклянный предметный столик и инкубируйте их при температуре 20 градусов Цельсия в течение как минимум 24 часов.
Чтобы денатурировать ДНК, подготовьте увлажненную камеру и осторожно поместите предметные стекла в банку Coplin, содержащую деионизированную или DI-воду, следя за тем, чтобы покрытые поверхности не касались стенок банки. Через 20 секунд инкубации вылейте воду. Добавьте 2,5 моляра соляной кислоты в банку Coplin, покрыв все предметные стекла.
После 80 минут инкубации дайте одну промывку PBS плюс 0,1% Tween, а затем две стирки PBS в течение трех минут каждая при комнатной температуре. Для иммуноокрашивания поместите предметные стекла в увлажненную камеру и заблокируйте их с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина или BSA в PBS на 30 минут при комнатной температуре. Затем накройте слайды прозрачным пластиковым листом.
После блокировки снимите покровное стекло и добавьте 100 микролитров раствора первичного антитела по длине предметного стекла. Добавьте новую пластиковую крышку и подождите два часа. Через два часа сбейте раствор антител и промойте предметные стекла в банке Coplin, заполненной PBS, два раза.
Снова заблокируйте предметные стекла, добавив 200 микролитров 5% BSA вдоль предметного стекла. Добавьте пластиковую крышку и выдерживайте 15 минут. Сняв покровное стекло и удалив излишки BSA с помощью бумажного полотенца, добавьте 100 микролитров раствора вторичных антител по длине предметного стекла и поместите новое пластиковое покрывало.
Через час снимите покровное стекло, сбейте излишки BSA на бумажное полотенце и дважды промойте предметные стекла в PBS. Добавьте 100 микролитров раствора третичного антитела по длине предметного стекла и поместите новый пластиковый защитный лист. Опять же, добавьте 200 микролитров 5% BSA вдоль каждого предметного стекла и выдерживайте в течение 15 минут.
После трех стирок с PBS удалите излишки PBS и дайте им полностью высохнуть. После высыхания нанесите монтажную среду на предметное стекло и поместите стеклопакеты, не допуская образования пузырьков. Визуализируйте иммуноокрашенные волокна ДНК с помощью иммунофлуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой, 60-кратным объективом и соответствующими наборами фильтров для обнаружения красителей Alexa Fluor 488 и 594.
Вариации паттернов репликации после длительного воздействия наноматериалов определяли путем сравнения паттернов репликации клеток до и после воздействия наночастиц йодоксиуридина и хлорйодоксиуридина. Анализ волокон ДНК и интерпретация изображений выявили закономерность для контрольных клеток макрофагов и ДНК макрофагов, обработанных оксидом графена-наночастицами. Вариация наблюдалась в паттерне репликационных промежуточных продуктов, демонстрируя увеличение новых источников в другой области того же состояния.
Окончательные данные о волокнах были получены путем разделения общей площади слайда на пять-шесть областей и получения нескольких изображений из каждой области. Выбор около 500 промежуточных продуктов из нескольких слайдов или условий был идеальным для исследования вариаций в динамике репликации ДНК. Анализ также показал увеличение только красных дорожек, что указывает на определения и уменьшение вновь возбужденных источников в клетках, обработанных оксидом графена, по сравнению с контролем.
Качество распространения волокон ДНК зависит от того, насколько хорошо волокна распространяются друг от друга и что они не перекрываются. После того, как волокна были распределены и IdU и CldU были окрашены, чрезвычайно важно найти волокна ДНК. Одна из вещей, которую вы можете сделать после того, как вы сделаете волокна ДНК, заключается в том, что, во-первых, вы можете посмотреть, как это влияет на динамику репликации.
Во-вторых, вы можете посмотреть, где находится повреждение ДНК относительно треков репликации ДНК. И последнее, если вы используете зонды FISH, вы действительно можете посмотреть на определенные области и на то, как на них влияет это повреждение ДНК. Этот метод прокладывает путь к разработке химиотерапевтических препаратов, дизайну лекарств и пониманию того, как на репликацию ДНК влияют различные типы белков.
