Нейронные реакции дают представление об активности мозга, но могут варьироваться в зависимости от экспериментов и отдельных людей. Этот протокол помогает автоматизировать запись и анализ стимуляции, а также упрощает программирование различных типов и шаблонов стимулов. Автоматизированный метод позволяет параллельно записывать несколько нейронов и организмов в одном и том же микрофлюидном формате.
Это улучшает повторяемость записей и позволяет исследовать изменчивость нейронов в разных популяциях. Для выявления нейронных явлений, таких как адаптация и сенсорная интеграция, необходимы различные паттерны стимуляции. Этот метод можно обобщить на другие динамические сигналы от клеток и органоидов к организмам и растениям.
Для начала включите микроскоп, наполните и удалите пузырьки воздуха из трубки резервуара с помощью шприца-заправщика, затем заполните выпускную трубку буфером. Извлеките микрофлюидное устройство из вакуумного эксикатора. Поместите прибор на микроскоп и быстро вставьте выходную трубку.
Осторожно нажмите на выходной шприц, чтобы ввести жидкость в устройство, пока капля не выйдет из входного отверстия. На этом входном отверстии, появившемся из капли, используйте каплевидное соединение, чтобы вставить соответствующую жидкостную впускную трубку, убедившись, что капли жидкости присутствуют как на впускной трубке, так и на иллюминаторе устройства, чтобы избежать образования пузырьков. Подсоедините следующую впускную трубку к следующей капле.
При необходимости впрысните больше жидкости из выпускного отверстия и повторяйте, пока не будут заполнены все входные отверстия. Вставьте сплошной блокирующий штифт в неиспользуемые входные отверстия и загрузочное отверстие червяка. Проверьте поток на экране, чтобы убедиться, что поток идет в нужном направлении.
Откидной клапан один на контроллере клапана и наблюдайте, как поток стимула течет в микрофлюидную арену. Если поток несбалансирован, отрегулируйте высоту резервуара. Перенесите молодых взрослых животных на незасеянную среду для роста нематод или агаровую пластину NGM с помощью проволочного наконечника, затем залейте пластину примерно пятью миллилитрами одного базального буфера XS, чтобы животные могли плавать.
Наберите червей в загрузочный шприц объемом от одного до трех миллилитров, используя прикрепленную трубку, предварительно заполненную одним базальным буфером XS. Используя стереоскоп, переместите трубку под поверхность жидкости одной рукой к каждому желаемому животному и втяните ее в трубку с помощью шприца, удерживаемого в другой руке. Закройте контур выпускного отверстия, снимите штифт загрузки червяка и подсоедините шприц загрузки червяка к устройству с помощью соединения типа «капля-капля».
Затем аккуратно выведите животных на арену. Установите буферный поток и подождите до одного часа для иммобилизации тетрамизолом. С помощью текстового редактора создайте текстовый файл определения стимула с именем userdefinedacquisitionsettings.
txt, содержащий настройки стимуляции для автоматического получения изображения. Этот файл определяет параметры сбора данных микроскопа, такие как время экспозиции и возбуждения, продолжительность испытания, интервалы и каталог сохранения. Он также определяет тип эксперимента и настройки времени стимуляции.
Для эксперимента с одним стимулом используйте формат только с одной повторяющейся командой стимуляции. Для эксперимента с несколькими шаблонами используйте формат с несколькими командами стимуляции, включив последовательность цифр шаблона, представляющую порядок шаблонов стимулов. Для каждого паттерна введите команду стимуляции в отдельной строке.
Затем запустите программное обеспечение для управления микроскопом. Убедитесь, что все входные отверстия жидкости открыты, поток желателен на арене, а интересующие нейроны находятся в фокусе в живом окне. Затем закройте живое окно и запустите скрипт multipatternrunscript.
BSH в программном обеспечении. Чтобы проанализировать данные, запустите NeuroTracker, последовательно нажимая на плагины, затем отслеживая, а затем NeuroTracker. Выберите папку, содержащую видеофайлы tiff для отслеживания, и выберите диапазон файлов для обработки.
Далее с помощью меню изображения и настройки откройте окна управления яркостью, контрастностью и порогом. Проверьте темный фон и не сбрасывайте диапазон в окне порогового значения, установив метод порогового значения по умолчанию, а визуализацию — красный. Затем нажмите «Авто» в окне контрастности яркости для видимости нейрона.
В окне ярко-контрастного экрана отрегулируйте минимальные и максимальные ползунки до тех пор, пока нейроны не станут четко различимы. Затем отрегулируйте пороговый уровень до тех пор, пока все нейроны не появятся в виде маленьких красных пятен, отделенных от других объектов. Отрегулируйте ползунок кадра, чтобы наблюдать за движением и изменениями интенсивности нейронов, отмечая любых животных, которых следует исключить из отслеживания, например, из-за перекрытия с другими животными.
После идентификации нейронов для отслеживания отрегулируйте пороговый уровень для каждого животного, если это необходимо, так, чтобы красная пороговая область над нейроном была видна в каждом кадре. Нажмите на нейрон, чтобы записать его положение и пороговый уровень. Когда все нейроны выбраны, нажмите пробел, чтобы начать отслеживание.
Следите за процессом отслеживания каждого животного и вносите необходимые коррективы. Если NeuroTracker приостанавливается, он теряет нейрон. Отрегулируйте пороговый уровень по мере необходимости и повторно щелкните нейрон.
Если поле интеграции перескакивает на другое соседнее животное или ненейронную структуру, нажмите пробел, чтобы сделать паузу. Переместите ползунок обратно в первый ошибочный кадр и повторно щелкните правильное расположение нейрона. Запустите neurotrackersummarypdf.
m в MATLAB и выберите папку, содержащую текстовые файлы данных NeuroTracker. Дождитесь создания сводного PDF-файла, позволяющего проверить процесс отслеживания. Животные могут быть идентифицированы по номерам и нейронным реакциям каждого животного и испытания, а также просмотрены для оценки изменчивости популяции.
Воспользуйтесь функцией DataBrowse. m для изучения нейронных данных, сгруппированных по номеру испытания, номеру животного, паттерну стимуляции или по другой категории. Явление временного торможения было протестировано в парном импульсном эксперименте, в результате которого было получено восемь паттернов, состоящих из двух односекундных импульсов одоранта, разделенных интервалом от нуля до 20 секунд.
Первый односекундный импульс запаха вызвал равную величину ответа в нейронах, обнаруживающих диацетил AWA, и ответы на второй импульс варьировались в зависимости от интервала между стимулами. Растормаживание оценивалось с помощью пробного эксперимента по вылову, в котором наблюдалась адаптация к диацетиловому стимулу, но презентация нового стимула 2-метилпиразина не вызывала сильного эффекта растормаживания. Испытанная мультимодальная стимуляция показала, что химическая стимуляция сама по себе вызывает адаптацию, тогда как оптическая стимуляция сама по себе не вызывает.
Однако комбинированный мультимодальный стимульный паттерн продемонстрировал, что оптогенные реакции восприимчивы к химически индуцированной адаптации. Модифицируя микрофлюидный дизайн, чтобы включить две арены, мы можем одновременно сравнивать генетические или другие возмущения вместе с соответствующим эталоном. После настройки систему можно модифицировать разными способами.
Например, мы автоматически измерили химические реакции на дозу и зависящие от состояния изменения нейронной активности, например, между состояниями сна и бодрствования.
