신경 반응은 뇌 활동에 대한 통찰력을 제공하지만 실험과 개인에 따라 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 자극 기록 및 분석을 자동화하고 다양한 유형 및 패턴의 자극 프로그래밍을 단순화함으로써 도움이 됩니다. 자동화된 기술을 통해 여러 뉴런과 유기체를 동일한 미세유체 형식으로 병렬로 기록할 수 있습니다.
이것은 기록의 반복성을 향상시키고 집단 전반에 걸친 신경 가변성을 탐색할 수 있게 해줍니다. 적응 및 감각 통합과 같은 신경 현상을 나타내기 위해서는 다양한 자극 패턴이 필요합니다. 이 방법은 세포와 오가노이드에서 유기체와 식물에 이르는 다른 동적 신호로 일반화할 수 있습니다.
시작하려면 현미경을 켜고 프라이밍 주사기를 사용하여 저장소 튜브에서 기포를 채우고 제거한 다음 유출 튜브에 버퍼를 채웁니다. 진공 건조기에서 미세 유체 장치를 제거합니다. 장치를 현미경에 놓고 배출 튜브를 빠르게 삽입합니다.
출구 주사기를 부드럽게 눌러 입구에서 물방울이 나올 때까지 장치에 유체를 주입합니다. 이 물방울이 나타난 입구에서 드롭 투 드롭 연결을 사용하여 해당 유체 입구 튜브를 삽입하고 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 입구 튜브와 장치 포트홀 모두에 액체 방울이 존재하도록 합니다. 다음 흡입 튜브를 다음 물방울에 연결합니다.
필요한 경우 배출구에서 더 많은 유체를 주입하고 모든 흡입구가 채워질 때까지 반복합니다. 사용하지 않는 입구와 웜 로딩 포트에 단단한 차단 핀을 삽입합니다. 화면의 흐름을 확인하여 흐름이 원하는 방향으로 진행되는지 확인합니다.
밸브 컨트롤러에서 밸브 1을 뒤집고 미세 유체 영역으로 흐르는 자극 흐름을 관찰합니다. 흐름이 불균형하면 저장소 높이를 조정하십시오. 와이어 팁 픽을 사용하여 어린 성인 동물을 씨를 뿌리지 않은 선충 성장 배지 또는 NGM 한천 플레이트에 옮긴 다음 동물이 수영할 수 있도록 약 5밀리리터의 XS 기초 완충액으로 플레이트를 범람시킵니다.
하나의 XS 기본 버퍼로 미리 채워진 부착된 튜브를 사용하여 1-3밀리리터 로딩 주사기에 웜을 그립니다. 입체경을 사용하여 한 손으로 튜브를 액체 표면 아래로 원하는 각 동물에게 옮기고 다른 손에 들고 있는 주사기를 사용하여 튜브로 끌어들입니다. 출구 윤곽을 닫고 웜 로딩 핀을 제거한 다음 드롭 투 드롭 연결을 사용하여 웜 로딩 주사기를 장치에 연결합니다.
그런 다음 동물을 경기장으로 부드럽게 흘립니다. 버퍼 흐름을 설정하고 테트라미솔에 의한 고정화를 위해 최대 1시간을 허용합니다. 텍스트 편집기를 사용하여 userdefinedacquisitionsettings라는 자극 정의 텍스트 파일을 만듭니다.
TXT에는 자동 이미지 획득을 위한 자극 설정이 포함되어 있습니다. 이 파일은 노출 및 여기 타이밍, 시험 기간, 간격 및 저장 디렉토리와 같은 현미경 획득 매개변수를 정의합니다. 또한 실험 유형 및 자극 타이밍 설정을 정의합니다.
단일 자극 실험의 경우 반복 자극 명령이 하나만 있는 형식을 사용합니다. 다중 패턴 실험의 경우, 자극 패턴의 순서를 나타내는 숫자의 패턴 시퀀스를 포함하여 다중 자극 명령이 있는 형식을 사용합니다. 각 패턴에 대해 별도의 줄에 자극 명령을 입력합니다.
그런 다음 현미경 제어 소프트웨어를 실행합니다. 모든 유체 흡입구가 열려 있는지, 경기장 내에서 흐름이 필요한지, 관심 있는 뉴런이 라이브 창 내에서 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 그런 다음 라이브 창을 닫고 multipatternrunscript 스크립트를 실행합니다.
소프트웨어 내에서 bsh. 데이터를 분석하려면 플러그인을 순차적으로 클릭한 다음 추적한 다음 NeuroTracker를 클릭하여 NeuroTracker를 실행합니다. 추적할 tiff 비디오 파일이 포함된 폴더를 선택하고 처리할 파일 범위를 선택합니다.
그런 다음 이미지 및 조정 메뉴를 사용하여 밝기 대비 및 임계 값 제어 창을 엽니 다. 어두운 배경을 확인하고 임계값 창에서 범위를 재설정하지 않고 임계값 지정 방법을 기본값으로 설정하고 시각화를 빨간색으로 설정합니다. 그런 다음 뉴런 가시성을 위해 밝기 대비 창에서 자동을 클릭합니다.
밝기 대비 창에서 뉴런을 명확하게 구분할 수 있을 때까지 최소 및 최대 슬라이더를 조정합니다. 그런 다음 모든 뉴런이 다른 물체와 분리된 작은 붉은 점으로 나타날 때까지 임계값 수준을 조정합니다. 프레임 슬라이더를 조정하여 뉴런의 움직임과 강도 변화를 관찰하고, 다른 동물과의 겹침 등 추적에서 제외해야 할 동물을 확인합니다.
추적할 뉴런을 식별한 후 필요한 경우 각 동물의 임계값 수준을 조정하여 뉴런 위의 빨간색 임계값 영역이 모든 프레임에서 보이도록 합니다. 뉴런을 클릭하여 위치와 임계값 수준을 기록합니다. 모든 뉴런이 선택되면 스페이스바를 눌러 추적을 시작합니다.
각 동물에 대한 추적 프로세스를 모니터링하고 필요한 수정을 수행합니다. NeuroTracker가 일시 중지되면 뉴런이 손실됩니다. 필요에 따라 임계값 수준을 조정하고 뉴런을 다시 클릭합니다.
통합 상자가 근처의 다른 동물 또는 비신경 구조로 이동하면 스페이스바를 눌러 일시 중지합니다. 슬라이더를 첫 번째 잘못된 프레임으로 다시 이동하고 올바른 뉴런 위치를 다시 클릭합니다. neurotrackersummarypdf를 실행합니다.
m 파일을 열고 NeuroTracker 데이터 텍스트 파일이 포함된 폴더를 선택합니다. 요약 PDF가 생성될 때까지 기다렸다가 추적 프로세스를 확인할 수 있습니다. 동물은 각 동물 및 시험의 수와 신경 반응으로 식별할 수 있으며 개체군 변동성을 평가하기 위해 관찰할 수 있습니다.
DataBrowse 함수를 사용합니다. m을 사용하여 시험 번호, 동물 번호, 자극 패턴 또는 다른 범주별로 그룹화된 신경 데이터를 탐색합니다. 시간적 억제 현상은 0에서 20초 범위의 간격으로 분리된 2개의 1초 냄새 펄스로 구성된 8개의 패턴을 생성하는 쌍 펄스 실험에서 테스트되었습니다.
첫 번째 1초 냄새 펄스는 디아세틸 감지 AWA 뉴런에서 동일한 반응 크기를 유도했으며 두 번째 펄스의 반응은 자극 간 간격에 따라 다양했습니다. 탈억제는 디아세틸 자극에 대한 적응이 관찰된 캐치 시험 실험에 의해 평가되었지만 새로운 2-메틸피라진 자극의 제시는 강력한 탈억제 효과를 이끌어내지 못했습니다. 테스트된 다중 모드 자극은 화학적 자극만으로는 적응을 유발하는 반면 광학 자극 단독으로는 적응을 일으키지 않는 것으로 나타났습니다.
그러나 결합된 다중 모드 자극 패턴은 광유전자 반응이 화학적으로 유도된 적응에 취약하다는 것을 보여주었습니다. 두 개의 영역을 포함하도록 미세유체 설계를 수정함으로써 일치하는 참조와 함께 유전적 또는 기타 섭동을 동시에 비교할 수 있습니다. 일단 설정되면 시스템을 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다.
예를 들어, 우리는 화학 물질 투여 반응과 수면 상태와 깨어있는 상태 사이와 같은 신경 활동에 대한 상태 의존적 변화를 자동으로 측정했습니다.
