Мы благодарим гистологическое ядро Национального института глаз (NEI) за использование конфокальной системы Zeiss. Эта работа была поддержана фондами NEI IRP (номер гранта ZIA EY000533-04).

Моделирование и анализ дегенерации сетчатки

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li><li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch's+membrane+and+choroid.">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li><li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy.">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model.">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+(Y402H)+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure.">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

Никаких разглашений.

Этот протокол обеспечивает метод эффективной маркировки, изображения и количественного определения липидных отложений в моногенных и полигенных моделях заболеваний in vitro для дегенеративных заболеваний глаз. Программное обеспечение на основе искусственного интеллекта LipidUNet может быть применено к трем распространенным липидным маркерам, APOE, Nile Red и BODIPY, и обеспечивает быстрый автоматический метод анализа, который позволяет количественной оценке быть стандартной и объективной.
Основным ограничением LipidUNet является тот факт, что набор обучающих данных для ИИ был ограничен изображениями клеток с 40-кратным увеличением, культивируемых в 96-луночном планшете. В результате набора обучающих изображений LipidUNet в его нынешнем виде ограничен анализом изображений с 40-кратным увеличением. Программное обеспечение может быть использовано для анализа 40-кратных изображений клеток, культивируемых на других культуральных поверхностях, помимо 96-луночной пластины, но следует позаботиться о проверке сгенерированных выходных масок для проверки точного порогового значения программным обеспечением. Потребуется больше наборов изображений (с разным увеличением), чтобы расширить область применения образцов/изображений, которые он может анализировать.
Протокол состоит из нескольких важных этапов. На этапе липидного маркера пользователь должен подтвердить, что выбранное им маркировочное соединение (BODIPY, APOE, Nile Red) эффективно маркировало его образец. Зрелые клетки RPE часто сильно пигментированы, что может ухудшить флуоресцентный сигнал иммуноокрашивания антителами. Когда сигнал флуоресценции слабый или когда слишком много фонового окрашивания, LipidUNet не может точно различать липидные капли. По той же причине необходимо использовать правильно выбранные параметры сбора данных для этапа автоматической визуализации протокола. Если полученные изображения имеют низкое качество, LipidUNet будет изо всех сил пытаться правильно маскировать изображения, и, следовательно, количественная оценка будет неточной (рис. 6A-L). Наконец, постобработка изображений является важным шагом, поскольку LipidUNet предъявляет особые требования к программному обеспечению для работы.
По сравнению с рабочими процессами для анализа липидов, в которых используется ручная пороговая оценка, или методами, включающими автоматическое пороговое значение в программном обеспечении, таком как Fiji, LipidUNet предлагает непредвзятую и надежную сегментацию по изображениям с переменным отложением липидов, что отражается в небольшой частоте ошибок при идентификации липидных частиц (рис. 7). Программное обеспечение позволяет пользователю вводить дополнительные обучающие изображения, что позволяет анализировать наборы изображений, выходящие за рамки тех, которые используют объектив 40-кратного увеличения, или даже тех, которые используют другой липидный маркер, как указано в протоколе. В будущем программное обеспечение будет обучено анализировать 3D-изображения, чтобы можно было количественно оценить объем липидных отложений. Дегенеративные заболевания глаз, которые связаны с отложением липидов в качестве основного фактора патологии, широко распространены, и, по прогнозам, случаи будут увеличиваться по мере увеличения пожилого населения13. Точные модели заболеваний и эффективные инструменты анализа, как мы изложили в этом протоколе, позволят разработать новые терапевтические вмешательства.

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) представляет собой монослой клеток, расположенных в задней части глаза, рядом с фоторецепторами сетчатки. RPE играет жизненно важную роль в поддержании правильного зрения, обеспечивая метаболическую и структурную поддержку фоторецепторов. Здоровые клетки RPE характеризуются отчетливой гексагональной морфологией. Они соединены плотными соединениями, которые позволяют РПЭ действовать как барьер между хориокапилляром, расположенным на его базальной стороне, и фоторецепторами, расположенными апикально. Для поддержания экосистемы сетчатки RPE перемещает ключевые метаболиты, например, глюкозу, к фоторецепторам таким образом, чтобы свести к минимуму потребление глюкозы в RPE1. Из-за этого ограничения RPE зависит от других метаболитов для поддержания своих метаболических потребностей, включая жирные кислоты, которые RPE превращает в кетоны посредством β-окисления2. Учитывая склонность RPE использовать жирные кислоты, которые, вероятно, рециркулируются в результате пищеварения внешнего сегмента фоторецепторов (POS), в качестве источника энергии, пагубные изменения в путях обработки липидов в RPE часто приводят или связаны как с моногенными, так и с полигенными дегенеративными заболеваниями сетчатки3.
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД), полигенное дегенеративное заболевание глаз, вызывающее дегенерацию РПЭ, также связано с аберрантной аутофагией и липидным обменом в монослое РПЭ. Неспособность дисфункционального монослоя RPE обрабатывать POS и выполнять другие критические функции приводит к внеклеточным (суб-RPE) отложениям, называемым базальными линейными отложениями (BLinD), расположенными между RPE и мембраной Бруха - отличительной чертой патологий ВМД. Основные компоненты BLinD включают липопротеины, наиболее распространенным из которых является аполипопротеин E (APOE)4. Накопление тонких слоев BLinD может привести к появлению мягких друз, которые признаются клиническим симптомомВМД 5,6.
Несколько групп показали, что модели заболеваний in vitro, полученные из стволовых клеток, которые вызывают дисфункцию RPE, характеризуются накоплением липидов sub-RPE 7,8,9. Hallam et al. (2017) получили индуцированный плюрипотентный RPE, полученный из стволовых клеток (iRPE), у пациентов с высоким риском развития ВМД из-за полиморфизма гена CFH. iRPE показал накопление друз, как отмечено APOE, а RPE с высоким риском накопил большие отложения, чем iRPE, генерируемый у пациентов с низким риском10.
Чтобы создать модель in vitro , которая повторяет клеточные признаки ВМД, такие как липидные капли и отложение друз, линии iRPE, полученные из образцов крови пациентов, были созданы с использованием ранее опубликованного протокола11, ориентированного на развитие. iRPE подвергали комплемент-компетентной сыворотке человека (CC-HS), раствору, содержащему анафилатоксины, которые имитируют одну из возможных причин ВМД: повышенную передачу сигналов альтернативного комплемента8. Результирующее клеточное и субклеточное отложение липидных отложений измеряли с использованием широко используемых липидных и липопротеиновых маркеров, APOE, Nile Red и BODIPY. С помощью этих маркеров было показано, что активированная передача сигналов комплемента через CC-HS усугубляет накопление липидов в клетках iRPE8.
Для разработки модели моногенного дегенеративного заболевания сетчатки были разработаны линии iRPE от пациентов с болезнью Штаргардта, заболеванием, вызванным мутациями гена ABCA4 в RPE. Ранее было показано, что при нокауте ABCA4 внутри RPE12 накапливается липофусцин A2E, внутриклеточное отложение, которое, как известно, содержит высокие уровни фосфолипидов и светозависимых продуктов перекисного окисления липидов. Нокаутирующие линии ABCA4 были разработаны наряду с линиями пациентов, и обе были подвергнуты POS-подаче. Stargardt iRPE продемонстрировал патологию, вызванную фагоцитозом POS, демонстрируя повышенное накопление липидов, количественно определяемое окрашиванием BODIPY. РПЭ, полученный из ИПСК ABCA4 KO, был подвергнут обработке CC-HS; количественная оценка сигнала BODIPY также показала дефект обработки липидов в модели болезни Штаргардта9.
Учитывая распространенность этих заболеваний и потребность в эффективных терапевтических средствах, наряду с соответствующими моделями заболеваний, описанными выше, необходимо разработать надежные методы количественной оценки эффективности потенциальных методов лечения. Для объективной, автоматизированной и стандартизированной количественной оценки липидных отложений было создано программное обеспечение на основе машинного обучения LipidUNet, чтобы в сочетании с инструментами анализа масок можно было быстро и эффективно идентифицировать отложение липидов с использованием общих маркеров Nile Red, BODIPY и APOE. Сводная статистика, полученная с помощью этого аналитического конвейера, затем может быть проанализирована и отображена графически, что позволяет легко сравнивать условия лечения. Схема протокола показана на рисунке 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема протокола: клетки RPE выращивают на 96-луночном планшете и подвергают воздействию активной сыворотки человека или очищенных наружных сегментов крупного рогатого скота для моделирования различных типов дегенерации сетчатки in vitro. Клетки RPE фиксируются и окрашиваются для отложений липопротеинов с помощью Nile Red, BODIPY и APOE. Конфокальный микроскоп используется для получения Z-стеков флуоресцентно меченных липидных частиц, которые впоследствии обрабатываются в 2D-проекции максимальной интенсивности. Алгоритм машинного обучения был обучен распознавать и правильно сегментировать частицы липопротеинов. Генерируются сводные таблицы, содержащие количество частиц и различные метрики формы, которые можно использовать для последующего построения графиков и статистического анализа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) представляет собой монослой гексагональных клеток, расположенных в задней части глаза. Он обеспечивает питание и поддержку фоторецепторов и хориоидальных капилляров, выполняет фагоцитоз наружных сегментов фоторецепторов (POS) и секретирует цитокины поляризованным образом для поддержания гомеостаза наружной сетчатки. Дисфункциональный RPE, вызванный мутациями, старением и факторами окружающей среды, приводит к дегенерации других слоев сетчатки и вызывает потерю зрения. Отличительной фенотипической особенностью дегенеративного РПЭ являются внутриклеточные и субклеточные отложения, богатые липидами. Эти отложения являются общим фенотипом при различных дегенеративных заболеваниях сетчатки. Для воспроизведения фенотипа липидного депонирования моногенных дегенераций сетчатки in vitro из фибробластов пациентов был получен индуцированный плюрипотентный RPE, полученный из стволовых клеток (iRPE). Клеточные линии, полученные от пациентов с болезнью Штаргардта и поздней дегенерацией сетчатки (L-ORD), получали POS в течение 7 дней для воспроизведения физиологической функции RPE, которая вызывала патологию, вызванную фагоцитозом POS при этих заболеваниях. Чтобы создать модель возрастной макулярной дегенерации (ВМД), полигенного заболевания, связанного с альтернативной активацией комплемента, iRPE был озадачен альтернативными анафилатоксинами комплемента. Внутриклеточные и субклеточные липидные отложения были охарактеризованы с использованием нильского красного, бор-дипиррометена (BODIPY) и аполипопротеина E (APOE). Для количественной оценки плотности отложений липидов было разработано программное обеспечение на основе машинного обучения LipidUNet. Программное обеспечение было обучено на проекционных изображениях iRPE максимальной интенсивности на культуральных поверхностях. В будущем он будет обучен анализировать трехмерные (3D) изображения и количественно определять объем липидных капель. Программное обеспечение LipidUNet станет ценным ресурсом для поиска лекарств, которые уменьшают накопление липидов в моделях заболеваний.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located in the back of the eye adjacent to retinal photoreceptors. RPE plays a vital role in maintaining proper vision by providing metabolic and structural support to the photoreceptors. Healthy RPE cells are characterized by a distinct hexagonal morphology. They are connected by tight junctions, which allow the RPE to act as a barrier between the choriocapillaris located on its basal side and photoreceptors located apically. To maintain the retinal ecosystem, RPE shuttles key metabolites, e.g., glucose, to photoreceptors in a way that minimizes glucose consumption in the RPE1. Due to this limitation, RPE depends on other metabolites to maintain their metabolic needs, including fatty acids, which RPE converts to ketones through &#946;-oxidation2. Given the propensity of RPE to utilize fatty acids, which are likely recycled from photoreceptor outer segment (POS) digestion, as an energy source, detrimental changes to the lipid processing pathways in RPE often lead to, or are implicated in, both monogenic and polygenic degenerative retinal diseases3.
Age-related macular degeneration (AMD), a polygenic degenerative eye disease that causes RPE degeneration, has also been linked to aberrant autophagy and lipid metabolism in the RPE monolayer. The failure of a dysfunctional RPE monolayer to process POS and perform other critical functions leads to extracellular (sub-RPE) deposits called basal linear deposits (BLinD) located between the RPE and Bruch&#39;s membrane - a hallmark of AMD pathologies. Major components of BLinD include lipoproteins, the most abundant of which is apolipoprotein E (APOE)4. Accumulation of thin layers of BLinD can lead to soft drusen, which is recognized as a clinical symptom of AMD5,6.
Several groups have shown that stem cell-derived in vitro disease models that cause RPE dysfunction feature sub-RPE lipid accumulation7,8,9. Hallam et al. (2017) generated induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) from patients with a high risk for AMD due to a polymorphism of the CFH gene. The iRPE showed drusen accumulation, as marked by APOE, and the high-risk RPE accumulated larger deposits than iRPE generated from low-risk patients10.
To create an in vitro model that recapitulates cellular hallmarks of AMD, such as lipid droplets and drusen deposition, iRPE lines generated from patient blood samples were established using a previously published developmentally guided protocol11. The iRPE were subjected to complement-competent human serum (CC-HS), a solution containing anaphylatoxins that mimic one possible cause of AMD: increased alternate complement signaling8. The resulting cellular and sub-cellular deposition of lipid deposits was measured using commonly used lipid and lipoprotein markers, APOE, Nile Red, and&#160;BODIPY. Through these markers, it was shown that activated complement signaling via CC-HS exacerbated lipid accumulation in iRPE cells8.
To develop a disease model for a monogenic retinal degenerative disease, iRPE lines were developed from patients with Stargardt disease, a disease caused by mutations to the ABCA4 gene in RPE. It has previously been shown that when ABCA4 is knocked out, A2E lipofuscin, an intracellular deposit known to contain high levels of phospholipids and light-dependent lipid peroxidation products, accumulates inside the RPE12. ABCA4 knockout lines were developed alongside the patient lines, and both were subjected to POS feeding. The Stargardt iRPE demonstrated POS phagocytosis-induced pathology, exhibiting increased lipid accumulation quantified by BODIPY staining. RPE derived from ABCA4 KO iPSCs were subjected to CC-HS treatment; quantification of the BODIPY signal showed a defect in lipid handling in the Stargardt disease model as well9.
Given the prevalence of these diseases and the need for effective therapeutics, along with the relevant disease models described above, there is a need to establish robust methods for quantifying the efficacy of potential treatments. To quantify lipid deposits in a way that is objective, automated, and standardized, a machine-learning-based software, LipidUNet, was created so that, when paired with mask analysis tools, lipid deposition can quickly and effectively be identified using the common markers Nile Red, BODIPY, and APOE. The summary statistics obtained using this analysis pipeline can then be analyzed and displayed graphically, allowing for easy comparison of treatment conditions. The schematic of the protocol is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic of the protocol: RPE cells are grown on a 96-well plate and challenged with active human serum or purified bovine outer segments to model different types of retinal degenerations in vitro. RPE cells are fixed and stained for lipoprotein deposits with Nile Red, BODIPY, and APOE. A confocal microscope is used to acquire Z-stacks of fluorescently-labeled lipid particles, which are subsequently processed into 2D maximum intensity projections. A machine-learning algorithm was trained to recognize and correctly segment lipoprotein particles. Summary tables containing particle count and various shape metrics are generated and can be used for subsequent plotting and statistical analysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

В центре внимания автора: Разгадка патогенеза возрастной макулярной дегенерации и открытие потенциальных методов лечения 

LipidUNet-Метод характеристики и количественной оценки липидных отложений с использованием пигментного эпителия сетчатки, полученного из iPSC

In this study, we aim to understand the age-related macro degeneration pathogenesis and find the potential treatment for it. This semi-automated pipeline for lipid droplet analysis provides a robust system to study metabolism and aging diseases. Our lab focuses on finding drug targets for the treatment of AMD either using genetic or small molecule screens that aimed at reducing the accumulation of lipid deposits.

Этот протокол обеспечивает рабочий процесс для идентификации липидных отложений, окрашенных Nile Red, BODIPY и APOE. Разработанное программное обеспечение может автоматически идентифицировать и количественно определять липидные отложения и лучше всего работает при оптимизации изложенного протокола. Приведены примеры успешно дифференцированного RPE (рис. 3A) и низкодифференцированного RPE (рис. 3B), поскольку качество модели ячеек сильно влияет на качество правильной сегментации изображения.
Два из трех маркеров, описанных в протоколе, Nile Red и BODIPY, идентифицированы как небольшие круглые точки, которые отчетливо ярки на флуоресцентных изображениях (рис. 5 и рис. 6). «Позитивное» изображение из протокола было бы подходящей идентификацией этих отдельных отложений (рис. 5A-D и рис. 5E-H). «Отрицательный» результат покажет неправильную сегментацию изображения, ошибочно приняв фоновую флуоресценцию за отложение, либо из-за слабого окрашивания (рис. 6A-C и рис. 6D-F), либо из-за высокой интенсивности фона (рис. 6G-I).
Месторождения APOE имеют различные размеры и формы, выглядя более овальными или нерегулярными, чем круглые отложения Nile Red и BODIPY. Эти отложения также менее точечные, и интенсивность сигнала может различаться между отложениями из-за различий в пермеабилизации образца. Правильная идентификация позволит идентифицировать каждое месторождение, включая менее насыщенные (рис. 5I-L), в то время как неправильная сегментация не выявит эти отложения (рис. 6J-L). Поэтому важно оптимизировать методы окрашивания и визуализации, чтобы избежать резких изменений. Один из способов сделать это — обратить пристальное внимание на этапы пермеабилизации образца во время иммуноокрашивания. Для оптимизации флуоресцентного сигнала клетки могут быть лизированы перед фиксацией и иммуноокрашиванием для APOE, что приводит к равномерному насыщению и лучшей сегментации отложений APOE.
Представлены также сегментированные изображения клеток, созревших на культуральной платформе, отличной от 96-луночной пластины. Программное обеспечение LipidUNet было запущено на изображениях клеток, культивируемых на трансвелле, и, хотя липидные отложения являются пороговыми, то же самое можно сказать и о порах в трансвелл-мембране (рис. 6M-O). Из-за сходства формы и размера программное обеспечение LipidUNet в его нынешнем виде будет маскировать как липидные отложения, так и прозрачные поры.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> Рисунок 5: Репрезентативные результаты. (A, E, I) 96-хорошо покрытый RPE окрашивается ядерным окрашиванием Хёхста (синий) и нильским красным (пурпурный), BODIPY (зеленый) или APOE (оранжевый) и являются проекциями максимальной интенсивности Z-стека. (Б, Ф, Дж) Входные изображения в оттенках серого для программного обеспечения LipidUNet после обработки изображений. (С,Г,К) Маски, генерируемые LipidUNet, где все отложения идентифицированы правильно. (Д,Ч,Л) Контуры каждой замаскированной частицы пронумерованы. Эти метки позволяют связать каждую частицу на изображении с записью в спреде с необработанными данными. (A-D) показывает окрашивание Nile Red, и программное обеспечение способно точно распознавать отложения на фоне, несмотря на более слабый сигнал. (E-H) показывает сильный контраст между сигналом BODIPY и фоном, что является идеальным. LipidUNet правильно идентифицирует каждое отложение на изображении. (I-L) показывает сильный сигнал APOE и представляет собой вариабельность насыщения сигнала, которая часто наблюдается с этим окрашиванием. Тем не менее, сегментация изображений способна идентифицировать границы каждого месторождения APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> Рисунок 6: Неоптимальные результаты. (A, D, G, J, M) 96-хорошо покрытые RPE окрашиваются ядерным окрашиванием Хёхста (синий) и нильским красным (пурпурный), BODIPY (зеленый) или APOE (оранжевый) и являются проекциями максимальной интенсивности Z-стека. (Б, Э, Х, К, Н) Входные изображения в оттенках серого для программного обеспечения LipidUNet после обработки изображений. (С, Ф, И, Л, О) Неправильные маски, сгенерированные LipidUNet. Красные круги указывают, где программное обеспечение неправильно идентифицировало липидное отложение. (А-С) Обработка Nile Red неверна, потому что программное обеспечение определило фоновое окрашивание как отложение. Это может происходить чаще, когда на изображении высокий фон, но мало липидных отложений. Показаны два примера окрашивания BODIPY: некачественное изображение из-за (D-F) слабого окрашивания BODIPY и (G - I) сильный сигнал BODIPY с высоким фоном. В обоих случаях программное обеспечение не может отличить небольшие круглые липидные отложения от фонового кольцевого кольца, окружающего ядро. Хотя окрашивание и визуализация должны быть оптимизированы, чтобы избежать этих ошибок, самая последняя версия LipidUNet в значительной степени улучшена для этих изображений. (Ж-Л) Некорректная сегментация APOE. Поскольку депозиты более изменчивы по размеру и насыщенности сигнала, программное обеспечение испытывает трудности с распознаванием некоторых депозитов. (М-О) РПЭ посеян на трансвелл и окрашен нильским красным цветом. Здесь показан срез Z-стека как с отложениями липидов Nile Red, так и с трансвеллированными порами. Программное обеспечение не может различить их, о чем свидетельствует красный круг, содержащий поперечные поры, и зеленая стрелка, указывающая на отложения Nile Red. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> Рисунок 7: Сравнение инструментов маски. (А, В, В) 96-хорошо покрытые РПЭ с переменным количеством осаждения липидов идентифицируются с красным нильским (красным). Изображения маскируются с использованием трех различных распространенных методов маскировки: Find Maxima, Max Entropy и Renyi Entropy, и сравниваются с маской, сгенерированной LipidUNet. Исходное изображение сопровождается ручным подсчетом липидных отложений, в то время как маски отображают прогнозируемые подсчеты по каждому методу сегментации. Средняя частота ошибок была рассчитана для каждого метода сегментации по следующей формуле: среднее[(|Прогнозируемый подсчет - ручной подсчет|/ручной подсчет) x 100]. Маска, сгенерированная LipidUNet, более точно идентифицирует липидные отложения на изображениях с переменным осаждением по сравнению с другими методами маскирования (средняя частота ошибок: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Компонент</td>
			<td>Номер кошки</td>
			<td>Биржевой конс.</td>
			<td>Заключительный конс.</td>
			<td>мл</td>
		</tr><tr><td>МЕМ альфа</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>Н.А.</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>Дополнение N2</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Н.А.</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Инактивированный теплом FBS</td>
			<td>Ш30071.03</td>
			<td>Н.А.</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>НМЭМ, НЕАА</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10мМ</td>
			<td>0,01 мМ</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Пируват натрия</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100 мМ</td>
			<td>1 мМ</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Пенициллин-стрептомицин</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 ед/мл</td>
			<td>100 Ед / мл</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Таурин</td>
			<td>Т4571</td>
			<td>50 мг/мл</td>
			<td>250 мкг/мл</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Гидрокортизон</td>
			<td>Н6909</td>
			<td>18,1 мг/л</td>
			<td>20 мкг/л</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>Т3</td>
			<td>Т5516</td>
			<td>20 мкг/л</td>
			<td>0,013 мкг/л</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Общий объем, мл</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Состав реагентов РПЭ-ММ. Перечень реагентов и оптимальных концентраций для РПЭ-ММ.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies at JoVE.com

Дегенеративные заболевания глаз, поражающие пигментный эпителиевый слой сетчатки глаза, имеют моногенное и полигенное происхождение. Было разработано несколько моделей заболеваний и программное обеспечение LipidUNet для изучения механизмов заболевания, а также потенциальных терапевтических вмешательств.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

В этом исследовании мы стремимся понять патогенез возрастной макродегенерации и найти потенциальное лечение этой проблемы. Этот полуавтоматический конвейер для анализа липидных капель представляет собой надежную систему для изучения метаболизма и болезней старения. Наша лаборатория специализируется на поиске лекарственных мишеней для лечения ВМД с использованием генетических или низкомолекулярных скринингов, направленных на снижение накопления липидных отложений.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

1.7K Views.  National Institutes of Health (NIH). В этом исследовании мы стремимся понять патогенез возрастной макродегенерации и найти потенциальное лечение этой проблемы. Этот полуавтоматический конвейер для анализа липидных капель представляет собой надежную систему для изучения метаболизма и болезней старения....

Video: В центре внимания автора: Разгадка патогенеза возрастной макулярной дегенерации и открытие потенциальных методов лечения 

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

Окрашивание отложений субретинального пигментного эпителия (РПЭ)  

To begin, dissolve Nile Red powder in acetone at three milligrams per milliliter concentration. Incubate the solution for 15 minutes at room temperature with periodic mixing. Filter the solution using a 0.22-micrometer filter once or twice depending on the amount of precipitate remaining in the solution.Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-500 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution to the paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate for 30 minutes at room temperature on a shaker protecting from light. After incubation, wash the samples twice with DPBS, then add 200 microliters of DPBS, and store them at four degrees Celsius.For BODIPY staining, prepare a 3.8-millimolar stock concentration by dissolving BODIPY in anhydrous DMSO. Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-300 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution of BODIPY to paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate overnight on a rocker at room temperature.The next day, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius. For APOE immunostaining, prepare a buffer solution by combining DPBS with 1%BSA, 0.5%Tween 20, and 0.5%Triton X-100. Block and permeabilize the paraformaldehyde-fixed RPE cells in 200 microliters of buffer solution for one hour.After incubation, add APPLE primary antibody diluted at one-to-100 in the buffer solution and incubate overnight at room temperature. The following day, wash the samples twice with DPBS. Then add 200 microliters of secondary antibody solution diluted at one-to-1000 for one hour at room temperature.After incubation, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius.

Окрашивание отложений субретинального пигментного эпителия (РПЭ)

Image Processing of REP Deposits, Segmentation, and Quantification

Обработка изображений отложений REP, сегментация и количественная оценка  

Using a confocal microscope and a 40X objective, create a scan profile with the appropriate fluorescent channels for the lipid marker used. After setting up the acquisition mode and channels, optimize the focus strategy by clicking on Software Autofocus. Then set the range of the Z Stack to 20 microns.After this, optimize tiles and open the viewer to select the tile positions. Next, using a batch image processing method, create maximum projections of each Z Stack with the extended depth of focus method. Before exporting the images, set the compression to none and ensure original data is checked.The resulting image is a maximum projection gray scale TIFF of only the fluorescence channel, expressing the lipid marker. Identify the TIFF images representing either Nile Red, BODIPY, or APOE and move them into the Images folder within a directory named either Nile Red, BODIPY, or APOE, depending on the method being used. Open the lipid unit software.In the Predict tab, select the relevant directory by clicking on the ellipsis and navigating to the named directory. Confirm that lipid unit has identified the images correctly by checking the class entry. Click Predict to observe the task progress, then using the Mask Analysis tool, iterate through the generated masks and provide a quantitative count of the threshold lipid deposits from the mask images.Successful differentiation and maturation of RPE showed a confluent monolayer with pigmentation and polygonal morphology. In contrast, unsuccessful differentiation showed clusters of dying cells. In fluorescent images, Nile Red and BODIPY deposits appeared as small, bright circular points.A negative result shows incorrect image segmentation by mistaking background fluorescence as a deposit, either due to weak staining or high background intensity. APOE deposits varying in size, shape, and signal intensity and requiring optimization of staining and imaging methods to minimize variation are shown.