Наши исследования сосредоточены на лейкемии, в частности на миелодиспластических синдромах или миелодиспластической неоплазии. Это заболевание стволовых клеток, происходящее из гемопоэтических стволовых клеток. Он влияет на различные линии клеток крови, особенно на эритроидную линию, которая отвечает за выработку сердечных клеток крови.
Нарушение этой линии может привести к анемии, которая обычно наблюдается у пациентов с МДС. Конвейер, который мы представляем в этой статье, позволяет использовать надежный и упрощенный метод оценки эффективности эритробластов человека in vitro при модификации генов или медикаментозном лечении. Гемопоэтические стволовые клетки присутствуют с рождения и до последнего момента нашей жизни.
В нашем организме больше нет пролиферативной ткани с триллионами клеток, производимых каждый день. Еще так много вещей нужно понять, поэтому мы продолжим изучать эти удивительные клетки в здоровых аминотканях, уделяя особое внимание протеостазу и биологии РНК. Для начала разморозьте 100 000 клеток CD34+UCK, опустив флакон на 30 секунд на водяную баню, установленную при температуре 37 градусов Цельсия.
Добавьте один миллилитр размораживающей среды по каплям во флакон, затем осторожно восстановите клетки, пипетируя вверх и вниз. Переложите ресуспендированную клеточную суспензию по капле в пять миллилитров размораживающей среды. Затем центрифугировать клеточную суспензию в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре.
Промойте клетки в 10 миллилитрах флуоресцентно-активируемой сортировки клеток или буфере FACS с ДНКазой. После повторного центрифугирования клеток повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах среды для стимуляции. Перелейте два миллилитра клеточной суспензии в 24-луночный планшет и инкубируйте планшет в течение четырех-шести часов при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем соберите клетки в пробирки для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, и долейте в них один миллилитр среды для стволовых клеток. После размораживания вируса добавьте необходимый объем в стимулирующую среду для достижения кратности инфекции 30. Ресуспендировать гранулированные клетки в вируссодержащих средах с плотностью 100 000 клеток на 100 микролитров вируса и перенести их в одну лунку 96-луночного планшета.
Добавьте PBS в пустые лунки и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Затем перенесите полный объем клеточной суспензии из лунки 96-луночного планшета в пробирки FACS с одним миллилитром среды стволовых клеток. Промойте лунку и наконечник пипетки средой для стволовых клеток, чтобы добавить два миллилитра среды стволовых клеток в пробирку FACS.
После центрифугирования трубки FACS выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах расширительной среды. Переложите суспензию в лунку на 24 лунки планшета и инкубируйте клетки. Для начала перенесите весь объем CD34+клеток, трансдуцированных с помощью репортера EGFP, в отдельную пробирку FACS.
Центрифугируйте при 320 G в течение восьми минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте гранулированные элементы в 100 микролитрах буфера FACS. Добавьте пять микролитров антител к CD34 в пробирку и инкубируйте пробирки в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.
Затем повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре буфера FACS, содержащем DAPI, и центрифугируйте в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре. После ресуспендирования клеток в 200 микролитрах буфера FACS, содержащего DAPI, перед сортировкой отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр с плотностью 40 микрометров. Далее добавьте 0,5 микролитра антитела CD34 на одну каплю гранул в 100 микролитров PBS.
Выдерживайте смесь в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. Затем добавьте в смесь один миллилитр PBS. Центрифугируйте в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре.
Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS. Затем добавьте GFP-отрицательные и GFP-положительные лейкозные клетки в пробирку FACS. Промойте ячейки в одном миллилитре буфера FACS.
После центрифугирования клеток ресуспендируют 100 000 GFP-отрицательных клеток и 100 000 GFP-положительных клеток, каждая в 500 микролитрах буфера FACS. Перед сортировкой отфильтруйте суспензию клеток через сетчатое фильтр 40 микрометров. Затем соберите отсортированные клетки в среду для стволовых клеток.
Центрифугируйте ячейки в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре. Затем ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах эритроидной дифференцировочной среды. Теперь распределите один миллилитр ресуспендированных клеток в три лунки 24-луночного планшета.
Заполните все внешние лунки PBS. Чтобы освежить носитель, убедитесь, что ячейки осели в нижней части пластины. Аккуратно наклоните пластину и удалите 500 микролитров среды.
Затем добавьте 500 микролитров 2Х среды для дифференцировки цитокина эритроидов для освежения пластины. На шестой день перенесите клетки в 12-луночный планшет и добавьте по одному миллилитру среды в каждую лунку, чтобы достичь конечного объема в два миллилитра. Соберите по 200 микролитров клеток из каждой лунки 12-луночного планшета.
Замените удаленный объем 250 микролитрами 2X среды для дифференцировки эритроидов. Добавьте один миллилитр буфера FACS в каждую пробирку для сбора. После центрифугирования пробирок повторно суспендируйте гранулированные элементы в 100 микролитрах буфера FACS.
Добавьте по одному микролитру антител к CD71, CD34 и CD235a в пробирки. Затем ресуспендируйте клетки в одном миллилитре буфера FACS, содержащего DAPI. Центрифугируйте пробирки в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре.
Ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах буфера FACS с DAPI. Установите DAPI в зависимости от бокового рассеивания или SSC, чтобы исключить мертвые ячейки. Установите высоту SSC относительно площади SSC, чтобы исключить агрегаты и выбрать отдельные ячейки.
Установите область рассеяния вперед относительно SSCA, чтобы удалить мусор в зависимости от размера. Установите CD235a против CD71. Установите CD34 против SSCA.
Прогоните бусины GFP-положительными клетками и DAPI-окрашенными клетками. Компенсируйте показания и примените компенсацию к настройкам цитометра. CD34-положительные клетки из пуповинной крови показали увеличение количества аннексин V положительных апоптотических клеток с 14,4% на четвертый день до 34,2% на 17-й день.
Гистограмма показывает значительное увеличение процента Аннексин V-положительных клеток к 17-му дню, достигая примерно 40%
