Мы предлагаем производить клетки крови из плюрипотентных стволовых клеток человека. Основным преимуществом этой техники является то, что мы получаем последовательные и точные урожаи гемогенных эндотелиальных клеток. Мы ожидаем, что наша платформа позволит широко использовать в мониторинге заболеваний и скрининге терапевтических соединений.
Этот метод особенно полезен для гематологических и иммунологических исследований. Метод может быть применен к генетическому вмешательству или редактированию генов клеток крови человека. Это позволяет легко индукции векторов в гемогенных эндотелиальных клеток.
Наиболее важным моментом является покрытие LM511-E8 для ввода колоний PSC. Мы не рекомендуем пропускать покрытие или заменять другой матрицей. Визуальные демонстрации важны, потому что мы хотим показать, как промыть клетки с буфером диссоциации и как покрыть пластины с LM511-E8.
Выращиваем плюрипотентные стволовые клетки человека или ГПСК до 70-80% на пластине с покрытием LM511-E8 в среде mTeSR1. За четыре дня до гемогенной индукции, аспирировать средний и мыть дважды с PBS. Промыть клетки раствором диссоциации и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут.
Перепробовать клетки в среде обслуживания PSC и перенести подвеску в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку. Центрифуга клетки при 200 раз G в течение трех минут. Аспирировать супернатант, и повторного перерасхода клеток в PSC покрытие среды.
Плита подвески PSC в соответствии с рукописными указаниями на микрофабрикаты пластикового сосуда, и инкубировать в одночасье. За три дня до гемогенной индукции, аккуратно пипетки сфероидов PSC в 15 миллилитров конической трубки и оставить их на две минуты при комнатной температуре, чтобы осадки под действием силы тяжести. Аспирировать супернатант и повторно высасывания сфероидов в сфероидных покрытия среды.
Распределите суспензию на блюдо культуры LM511-E8 с 10-сантиметровым покрытием при плотности четыре сфероида на квадратный сантиметр и инкубировать в течение трех дней. Через три дня, аспирировать среды, добавить день нулевой дифференциации среды, и культуры клеток в течение двух дней в гипоксический инкубатор. Затем, аспирировать день нулевой среды, добавить день два дифференциации среды, и культуры еще на два дня.
Два дня спустя, аспирировать среды и мыть клетки дважды с PBS. Промыть клетки раствором диссоциации и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. После инкубации отмежеваться от клеток, мягко resuspending их в один миллимолярд EDTA.
Перенесите суспензию в 50 миллилитровую коническую трубку и центрифуга клетки в 200 раз G в течение трех минут. Аспирировать супернатант и повторно поместью клеточной гранулы с 300 микролитров магнитного буфера разделения. Добавьте 100 микролитров CD34-положительных микробусов в клетки и аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем использовать 40 микрометровый ситечко клетки для деформации подвески и отделить CD34-положительных клеток с помощью магнитного сепаратора. Выделять 0,5 миллилитров по 5 микрограмм на миллилитр фибронектин покрытие раствора в каждый колодец 24 хорошо культуры пластины, и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут. Между тем, центрифуга отсортированных CD34-положительных клеток в 200 раз G в течение трех минут, и повторно гранулы в один миллилитр ЭГТ среды.
Определите жизнеспособную плотность клеток с помощью клеточного счетчика и отрегулируйте плотность клеток до 200 000 клеток на миллилитр, добавив среду EHT. Аспират и отказаться от покрытия раствор из фибронектина покрытием скважин, и обойтись 0,5 миллилитров CD34-положительной клеточной подвески в каждой скважине. Инкубировать клетки в гипоксический инкубатор в течение одной недели.
Чтобы собрать плавающие клетки, перенесите культурную среду в 15 миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 200 Г в течение трех минут. Затем аспирировать супернатанта. Чтобы собрать адепт клетки, мыть их дважды с 0,5 миллилитров PBS, и промыть их с разобщающих буфера.
Аспирировать излишки жидкости и инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Переусейте клетки в одном миллилитре буфера Facs и смешайте плавающие и приверженные клетки. Центрифуга смешанных клеток в 200 раз G в течение трех минут, а затем аспирировать супернатант и повторного перерасхода клеток в 50 микролитров буфера Facs.
Разбавить анти-CD34 и анти-CD45 антител в 50 микролитров буфера Facs;добавить их в клетки и инкубировать клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Затем, мыть клетки дважды с PBS, центрифугирование в 200 раз G в течение трех минут после каждого мытья. Аспирировать супернатант и повторно изымать клетки в 0,5 миллилитров буфера Facs с 0,5 микрограмма на миллилитр dappy.
Измерьте выражение CD34 и CD45 по цитометрии потока. Чтобы собрать гематопоэтические клетки, перенесите культурную среду в 15 миллилитровую коническую трубку. Соберите оставшиеся клетки, аккуратно полоскания хорошо в два раза с PBS.
Центрифуга клеток в 200 раз G в течение трех минут, то аспирировать супернатант и повторно в один миллилитр ЭГТ среды. После подсчета клеток, добавить 10000 клеток до трех миллилитров метилцеллюлозы пространства средств массовой информации, дополненные антибиотиками, и использовать 16 калибровочный шприц, чтобы смешать пять раз. Разпределите всю подвеску мультимедиа в каждый колодец из шести хорошо пластины.
Чтобы сохранить клетки влажными, добавить воду или PBS в пустые колодцы на тарелке. Инкубировать клетки в течение двух недель, убедившись, что не беспокоить блюдо, как колонии движения чувствительны. Через две недели посчитайте колонии под микроскопом.
Морфологически клетки меняются от эндотелиальных к гематопоэтическим клеткам при стимуляции гематопоэтическим коктейлем. Гематопоэтические клеточные колонии возникают в культуре. Гематопоэтические клетки-предшественники выражают CD34 и CD45, поэтому цитометрия потока используется для подтверждения присутствия гематопоэтических клеточных колоний путем анализа экспрессии CD34 и CD45.
Анализ единицы колонии продемонстрировал генерацию гранулоцитов или колоний макрофагов из CD34-положительных и CD45-положительных гематопоэтических клеток-предшественников. Численность колонии оценивалась в 38 колоний, образующих единицы на 10 000 камер. Наиболее важными шагами являются подсчет сфероидов PSC.
Мы обнаружили, что поверхностный показатель является наиболее детерминистским фактором эффективности этого протокола. За этой процедурой может последовать производство готовых инертических клеток, таких как естественные клетки и макрофаги. Эта платформа позволяет исследователям исследовать ключевые детерминистские факторы в развитии гематопоэтического человека.
