La nostra ricerca si concentra sulle leucemie, in particolare sulle sindromi mielodisplastiche o neoplasie mielodisplastiche. È una malattia delle cellule staminali originata dalle cellule staminali ematopoietiche. Colpisce vari lignaggi di cellule del sangue, in particolare il lignaggio eritroide, che è responsabile della produzione di cellule del sangue del cuore.
L'interruzione di questo lignaggio può portare all'anemia, che è comunemente osservata nei pazienti con SMD. La pipeline che forniamo in questo articolo consente un metodo robusto e semplificato per valutare l'efficienza dell'eritroblasto umano in vitro dopo la modifica genica o il trattamento farmacologico. Le cellule staminali ematopoietiche sono presenti dalla nascita fino all'ultimo istante della nostra vita.
Non c'è più tessuto proliferativo nel nostro organismo con trilioni di cellule prodotte ogni giorno. Ci sono ancora così tante cose da capire, quindi continueremo a studiare queste incredibili cellule in tessuti amminici sani con una forte enfasi sulla proteostasi e sulla biologia dell'RNA. Per iniziare, scongelare 100.000 cellule CD34+UCB immergendo la fiala per 30 secondi in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius.
Aggiungere un millilitro di terreno di scongelamento goccia a goccia nella fiala, quindi risospendere delicatamente le cellule pipettando su e giù. Trasferire la sospensione della cella risoluta goccia a goccia in cinque millilitri di terreno di sbrinamento. Quindi centrifugare la sospensione cellulare per otto minuti a 320 G a temperatura ambiente.
Lavare le cellule in 10 millilitri di smistamento cellulare attivato da fluorescenza o tampone FACS con DNAsi. Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, risospendere il pellet in due millilitri di mezzo di stimolazione. Trasferire due millilitri di sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra per quattro-sei ore a 37 gradi Celsius.
Quindi raccogliere le cellule in provette di smistamento cellulare attivate dalla fluorescenza e rabboccarle con un millilitro di terreno di coltura delle cellule staminali. Dopo aver scongelato il virus, aggiungere il volume necessario ai mezzi di stimolazione per ottenere una molteplicità di infezioni di 30. Risospendere le cellule pellettate in terreni contenenti virus a una densità di 100.000 cellule per 100 microlitri di virus e trasferirle in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Aggiungere PBS ai pozzetti vuoti e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Quindi trasferire l'intero volume della sospensione cellulare dal pozzetto della piastra a 96 pozzetti in provette FACS con un millilitro di terreno di coltura di cellule staminali. Lavare il pozzetto e il puntale della pipetta con terreno di coltura per cellule staminali per aggiungere due millilitri di terreno di coltura con cellule staminali alla provetta FACS.
Dopo aver centrifugato la provetta FACS, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di mezzo di espansione. Trasferire la sospensione in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare le cellule. Per iniziare, trasferire l'intero volume di cellule CD34+ trasdotte con il reporter EGFP in una provetta FACS separata.
Centrifugare a 320 G per otto minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule pellettate in 100 microlitri di tampone FACS. Aggiungere cinque microlitri di anticorpi CD34 per provetta e incubare le provette al buio a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi risospendere le cellule in un millilitro di tampone FACS contenente DAPI e centrifugare per otto minuti a 320 G a temperatura ambiente. Dopo aver risospeso le cellule in 200 microlitri di tampone FACS contenente DAPI, filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 micrometri prima della cernita. Quindi, aggiungere 0,5 microlitri di anticorpo CD34 a una goccia di perline in 100 microlitri di PBS.
Incubare la miscela al buio a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di PBS al composto. Centrifugare per otto minuti a 320 g a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere le cellule leucemiche GFP-negative e GFP-positive a una provetta FACS. Lavare le cellule in un millilitro di tampone FACS.
Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere 100.000 cellule GFP-negative e 100.000 cellule GFP-positive, ciascuna in 500 microlitri di tampone FACS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 micrometri prima della cernita. Quindi raccogliere le cellule selezionate nel terreno delle cellule staminali.
Centrifugare le celle per otto minuti a 320 g a temperatura ambiente. Quindi risospendere le cellule in tre millilitri di terreno di differenziazione eritroide. Ora erogare un millilitro di cellule risospese in tre pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
Riempi tutti i pozzetti esterni con PBS. Per rinfrescare il terreno, assicurarsi che le celle si siano depositate sul fondo della piastra. Appoggiare delicatamente la piastra e rimuovere 500 microlitri di supporto.
Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno di differenziazione eritroide con citochine 2X per rinfrescare la piastra. Il sesto giorno, trasferire le cellule in una piastra a 12 pozzetti e aggiungere un millilitro di terreno a ciascun pozzetto per raggiungere un volume finale di due millilitri. Raccogliere 200 microlitri di cellule da ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti.
Sostituire il volume rimosso con 250 microlitri di terreno di differenziazione eritroide 2X. Aggiungere un millilitro di tampone FACS a ciascuna provetta di raccolta. Dopo aver centrifugato le provette, risospendere le cellule pellettate in 100 microlitri di tampone FACS.
Aggiungere un microlitro ciascuno di anticorpi CD71, CD34 e CD235a alle provette. Quindi risospendere le cellule in un millilitro di tampone FACS contenente DAPI. Centrifugare le provette per otto minuti a 320 g a temperatura ambiente.
Risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone FACS con DAPI. Impostare DAPI rispetto alla dispersione laterale o SSC per escludere le celle morte. Impostare l'altezza SSC rispetto all'area SSC per escludere gli aggregati e selezionare le singole celle.
Impostare l'area di dispersione in avanti rispetto a SSCA per rimuovere i detriti in base alle dimensioni. Impostare CD235a contro CD71. Impostare CD34 rispetto a SSCA.
Far scorrere le perle, le celle GFP-positive e le cellule colorate con DAPI. Compensare le letture e applicare la compensazione alle impostazioni del citometro. Le cellule CD34-positive del sangue del cordone ombelicale hanno mostrato un aumento delle cellule apoptotiche positive all'annessina V dal 14,4% del quarto giorno al 34,2% del giorno 17.
Il grafico a barre mostra un aumento significativo della percentuale di cellule V-positive all'annessina V entro il giorno 17, raggiungendo circa il 40%
