Nossa pesquisa se concentra na leucemia, especificamente nas síndromes mielodisplásicas ou neoplasias mielodisplásicas. É uma doença com células-tronco originada de células-tronco hematopoiéticas. Afeta várias linhagens de células sanguíneas, particularmente a linhagem eritróide, que é responsável pela produção de células sanguíneas do coração.
A ruptura dessa linhagem pode levar à anemia, que é comumente observada em pacientes com SMD. O pipeline que fornecemos neste artigo permite um método robusto e simplificado para avaliar a eficiência do eritroblasto humano in vitro após modificação genética ou tratamento medicamentoso. As células-tronco hematopoiéticas estão presentes desde o nascimento até o último momento de nossas vidas.
Não há mais tecido proliferativo em nosso organismo com trilhões de células produzidas todos os dias. Ainda há muitas coisas para entender, então continuaremos estudando essas células incríveis em tecidos aminoácidos saudáveis com forte ênfase na proteostase e na biologia do RNA. Para começar, descongele 100.000 células CD34 + UCB mergulhando o frasco por 30 segundos em banho-maria ajustado para 37 graus Celsius.
Adicione um mililitro de meio de descongelamento gota a gota ao frasco e, em seguida, ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo. Transfira a suspensão da célula ressuspensa gota a gota para cinco mililitros de meio de descongelamento. Em seguida, centrifugue a suspensão da célula durante oito minutos a 320 g à temperatura ambiente.
Lave as células em 10 mililitros de classificação de células ativadas por fluorescência ou tampão FACS com DNAse. Depois de centrifugar as células novamente, ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio de estimulação. Transfira dois mililitros de suspensão celular para uma placa de 24 poços e incube a placa por quatro a seis horas a 37 graus Celsius.
Em seguida, colete as células em tubos de classificação de células ativadas por fluorescência e complete-as com um mililitro de meio de células-tronco. Depois de descongelar o vírus, adicione o volume necessário ao meio de estimulação para atingir uma multiplicidade de infecção de 30. Ressuspenda as células peletizadas em meios contendo vírus a uma densidade de 100.000 células por 100 microlitros de vírus e transfira-as para um poço de uma placa de 96 poços.
Adicione PBS aos poços vazios e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira todo o volume da suspensão celular do poço da placa de 96 poços para tubos FACS com um mililitro de meio de células-tronco. Lave o poço e a ponta da pipeta com meio de células-tronco para adicionar dois mililitros de meio de células-tronco ao tubo FACS.
Depois de centrifugar o tubo FACS, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em dois mililitros de meios de expansão. Transfira a suspensão para um poço de uma placa de 24 poços e incube as células. Para começar, transfira o volume total de células CD34 + transduzidas com o repórter EGFP para um tubo FACS separado.
Centrifugue a 320 g por oito minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda as células peletizadas em 100 microlitros de tampão FACS. Adicione cinco microlitros de anticorpo CD34 por tubo e incube os tubos no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, ressuspender as células em um mililitro de tampão FACS contendo DAPI e centrifugar por oito minutos a 320 G à temperatura ambiente. Depois de ressuspender as células em 200 microlitros de tampão FACS contendo DAPI, filtre a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros antes da classificação. Em seguida, adicione 0,5 microlitros de anticorpo CD34 a uma gota de grânulos em 100 microlitros de PBS.
Incube a mistura no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de PBS à mistura. Centrifugar durante oito minutos a 320 g à temperatura ambiente.
Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 microlitros de PBS. Em seguida, adicione células leucêmicas GFP-negativas e GFP-positivas a um tubo FACS. Lave as células em um mililitro de tampão FACS.
Depois de centrifugar as células, ressuspenda 100.000 células GFP-negativas e 100.000 células GFP-positivas, cada uma em 500 microlitros de tampão FACS. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de 40 micrómetros antes da triagem. Em seguida, colete as células classificadas em meio de células-tronco.
Centrifugue as células durante oito minutos a 320 G à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda as células em três mililitros de meios de diferenciação eritróide. Agora dispense um mililitro das células ressuspensas em três poços de uma placa de 24 poços.
Encha todos os poços externos com PBS. Para atualizar a mídia, certifique-se de que as células tenham se acomodado na parte inferior da placa. Incline suavemente a placa e remova 500 microlitros de mídia.
Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de diferenciação eritróide de citocina 2X para refrescar a placa. No sexto dia, transfira as células para uma placa de 12 poços e adicione um mililitro de meio a cada poço para atingir um volume final de dois mililitros. Colete 200 microlitros de células de cada poço da placa de 12 poços.
Substitua o volume removido por 250 microlitros de meios de diferenciação eritróide 2X. Adicione um mililitro de tampão FACS a cada tubo de coleta. Depois de centrifugar os tubos, ressuspenda as células peletizadas em 100 microlitros de tampão FACS.
Adicione um microlitro de cada um dos anticorpos CD71, CD34 e CD235a aos tubos. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de tampão FACS contendo DAPI. Centrifugar os tubos durante oito minutos a 320 g à temperatura ambiente.
Ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão FACS com DAPI. Defina DAPI versus dispersão lateral ou SSC para excluir células mortas. Defina a altura do SSC versus a área do SSC para excluir agregados e selecionar células únicas.
Defina a área de dispersão avançada versus SSCA para remover detritos com base no tamanho. Conjunto CD235a versus CD71. Conjunto CD34 versus SSCA.
Execute grânulos de células positivas para GFP e células coradas com DAPI. Compense as leituras e aplique a compensação às configurações do citômetro. As células CD34-positivas do sangue do cordão umbilical exibiram um aumento nas células apoptóticas positivas para Anexina V de 14,4% no quarto dia para 34,2% no dia 17.
O gráfico de barras mostra um aumento significativo na porcentagem de células positivas para Anexina V no dia 17, atingindo aproximadamente 40%
