Гибридный ансамблевый и одномолекулярный анализ для визуализации движения полностью восстановленного КМГ

Мы изучаем динамику движения различных компонентов эукариотической репликимы на уровне одной молекулы. Для того, чтобы получить глубокое количественное понимание того, как клетки могут дублировать весь свой геном, каждый клеточный цикл. В 2015 году репликация эукариотической ДНК была полностью восстановлена in vitro из очищенных белковых компонентов.

И это дало нам большой контроль над системой. И с тех пор он широко используется для ответа на вопросы о различных стадиях репликации ДНК с увеличением временного и пространственного разрешения. И это было сделано с помощью взаимодополняющих подходов, таких как крио-ЭМ и биофизика одиночных молекул.

В области одиночных молекул одной из самых больших проблем с этой системой является количество задействованных белков, а также концентрации, при которых эти компоненты необходимы для максимизации эффективности всей реакции, поскольку это может усложнить визуализацию одной молекулы. Описанный здесь протокол представляет собой гибридный подход, при котором белковый комплекс сначала эффективно собирается с использованием ансамблевой биохимии, а затем вводится и изучается в условиях одной молекулы. Это позволяет избежать введения двух высоких концентраций белка на уровне одной молекулы.

Мы иллюстрируем этот подход для изучения поведения репликативной геликазы CMG на уровне ДНК на уровне одной молекулы после ее сборки по исходному пути. Но этот подход также может быть использован для изучения динамики многих других типов ДНК-связывающих белковых комплексов.