Медицинские устройства с барьером для крови, необходимые для интенсивной терапии, часто сталкиваются с образованием тромбов, нарушением функции и повышенным риском системного тромбоза. Клинические антикоагулянты смягчают тромбоз, но повышают риск кровотечений. Абсорбция белка на поверхности биоматериала вызывает коагуляцию и воспаление.
Мы исследовали влияние промывки полимера zoura через покрытие на абсорбцию белка в контуре ЭКМО. В настоящее время не существует коммерческого антикоагулянта, который избирательно и эффективно подавляет тромбоз в медицинских устройствах, не воздействуя на пациента. Кроме того, важно оптимизировать и продемонстрировать эффективность поверхностных покрытий и инженерных разработок в течение нескольких дней, недель и даже месяцев для различных медицинских устройств.
Наши новые научные задачи включают в себя оценку влияния различных подходов к предварительной обработке на нанесение покрытий, оценку влияния методов обработки решения для промывочного покрытия на однородность покрытия, исследование влияния альтернативных противообрастающих полимерных трансплантатов на неспецифическое белковое загрязнение и определение способности оптимизированных покрытий ограничивать тромбоз in vivo. Чтобы очистить легочный контур, рециркулируйте 30% метанола в деионизированной воде в течение 20 минут. После этого рециркулируйте 10% метанола в деионизированной воде, а затем только в деионизированной воде в течение еще 20 минут.
Осушите легочный контур отфильтрованным воздухом в помещении с низким расходом в течение двух часов. Поместите очищенный и высушенный контур легких в генератор ультрафиолетовой озонолиза плазмы. Закройте генератор и включите прибор для начала плазменного воздействия на 20 минут.
После завершения плазменного воздействия приступайте непосредственно к этапу нанесения покрытия, чтобы предотвратить перестройку поверхностной цепи и потерю реакционноспособных центров, образующихся при взаимодействии с плазмой. Пока устройство подвергается модификации поверхности, растворите 1,2 грамма гидрохлорида дофамина в 600 миллилитрах трис-буфера в стеклянном стакане. Впоследствии растворяют мономер сульфобетаина метакрилата в соотношении один к 15 дофамина гидрохлорида к сульфобетаина метакрилату.
Затем добавьте пять миллимоляров карбоната натрия в виде капель в раствор для покрытия. Используйте магнитную мешалку и мешалку, установленную на 150 об/мин, чтобы тщательно перемешать раствор. Затем загрунтуйте легочное устройство раствором покрытия с помощью большого шприца, чтобы набрать и заполнить контур.
Зажмите один конец цепи и загрунтуйте его с другого конца, направляя пузырьки воздуха через разъем доступа к цепи. После того, как цепь будет полностью заполнена, поместите устройство под источник ультрафиолетового света на два часа. Взбалтывайте решение, переориентируя концы основного устройства вверх и вниз каждые 10 минут.
После обработки светом полностью слейте воду из контура. Аккуратно промойте все образцы деионизированной водой, загрунтовав и скачав воду с помощью шприца объемом 60 кубических сантиметров, пока стоки для промывки не станут прозрачными. Наконец, храните устройство, наполненное деионизированной водой, в холодильнике, установленном при температуре четыре градуса Цельсия для вскрытия и анализа поверхности.
Чтобы провести тест на абсорбцию фибриногена, перенесите образцы волокнистого мата в один миллилитр трех миллиграммов на миллилитр раствора фибриногена в луночные планшеты и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 90 минут при 60 оборотах в минуту. Промойте образцы с помощью PBS. Переложите их в новые лунки и добавьте в каждую лунку по одному миллилитру одного миллиграмм на миллилитр раствора БСА.
Выдерживать еще 90 минут. Затем промыть образцы еще три раза раствором PBS и перенести их в новые лунки. Далее добавьте в каждую лунку по одному миллилитру одного к 1000 разведенного антитела к пероксидазе пероксидазы хрена в растворе PBS.
После инкубации образцов в течение 30 минут и их промывки, перенесите их в новые лунки. В новые лунки добавьте 500 микролитров офенилендиамина в цитратно-фосфатный буфер с 0,03% перекисью водорода, доведенную до pH 5,0 с интервалом в 30 секунд. Инкубируйте образцы вдали от света в течение 30 минут.
Чтобы остановить реакцию пероксидазы и офенилендиамина, добавьте в каждую лунку по 500 микролитров одной обычной соляной кислоты. Переложите надосадочную жидкость из каждой лунки в кювету. Измерьте поглощение надосадочной жидкости на 492 нанометрах с помощью УФ-видимого спектрофотометра.
Разморозьте набор для анализа лактатдегидрогеназы в течение 20 минут. Пока набор для анализа оттаивает, подготовьте объединенную плазму взрослого человека для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы на основе центрифуги размораживают пробирки с образцами плазмы человека при давлении 483 G, чтобы разделить плазму на две области.
Определите нижнюю треть, содержащую обогащенную тромбоцитами плазму, и верхние две трети, содержащие бедную тромбоцитами плазму. Осторожно удалите тромбоцитарные гранулы на дне пробирок и верхние две трети, содержащие бедную тромбоцитами плазму. Аккуратно диспергируйте тромбоцитарную гранулу в верхнюю плазму, встряхивая трубки.
Перед тестированием добавьте хлорид кальция в обогащенную тромбоцитами плазму, чтобы обратить вспять действие цитратов. Затем инкубируйте образцы волокнистого мата в 500 микролитрах обогащенной тромбоцитами плазмы в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации переложите образцы в новые лунки и трижды промойте раствором PBS.
Опять же, перенесите образцы в новые скважины. Добавьте в каждую лунку 300 микролитров раствора PBS и 10 микролитров 10 X лизисного буфера. Инкубируйте образцы в течение 45 минут, затем добавьте по 50 микролитров реакционной смеси в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут вдали от света.
Добавьте в каждую лунку по 50 микролитров соляной кислоты, чтобы остановить реакции. Для определения активности лактатдегидрогеназы из лизатов абсорбированных тромбоцитов измеряют светопоглощение разработанных растворов лунок на 490 нм и 680 нм. Загрязнение фибриногеном было значительно снижено в кодированных волокнах PP-PDMS по сравнению с контрольной продукцией без покрытия.
Не было существенной разницы в загрязнении фибриногеном между наружными и внутренними пучками в волокнах PP-PDMS в условиях отсутствия текучести. При 24-часовом потоке PBS загрязнение фибриногеном во внешнем и внутреннем пучках оставалось низким и не демонстрировало существенных различий. Загрязнение тромбоцитов было выше во внешнем пучке волокон PP-PDMS, чем во внутреннем пучке, и в контроле без покрытия.
Загрязнение тромбоцитов было значительно выше во внешнем пучке по сравнению с волокнами PP-PDMS, кодируемыми во внутреннем пучке, без воздействия потока. При 24-часовом потоке PBS не наблюдалось существенной разницы в загрязнении тромбоцитов между наружными и внутренними пучками с низким уровнем загрязнения.
