Этот протокол позволяет повторно использовать интактный внеклеточный матрикс легких в качестве трехмерного субстрата культуры тканей и умеренную пропускную способность. Основным преимуществом инженерной системы легочной ткани является гибкость платформы. ELT могут быть адаптированы для использования различных тканевых каркасов, клеток или культуральных сред, представляющих интерес.
Как только легкие будут извлечены, заполните 10-миллилитровый шприц агарозой и HBSS без фенол-красного цвета. Надувайте легкие примерно 10 миллилитрами воздуха через канюлю трахеи, затем немедленно вводите приготовленную агарозу через канюлю трахеи до тех пор, пока не будут раздуты самые дистальные кончики долей легких. Закройте трахею, прикрепив белый колпачок от четырехстороннего запорного крана к женскому замку трахеи.
Поместите легкое в 150-миллиметровую чашку Петри на льду, чтобы агароза затвердела. Подготовьте ломтики легких согласно протоколу в рукописи, а затем заполните 100-миллиметровую чашку Петри 1/3 объемом PBS. Переложите кассеты и вкладки на блюдо с помощью щипцов.
Если ломтики заморожены, разморозьте по одному блюду за раз, вылив на PBS комнатной температуры. Затем переложите размороженный ломтик на 150-миллиметровую чашку Петри. Аккуратно разверните срез с помощью тонких щипцов или гемостата и осторожно аспирируйте избыток PBS вокруг ткани.
Затем вырежьте из среза полоску шириной три миллиметра, не менее девяти миллиметров, плотно прижав по всей длине лезвие бритвы к блюду и слегка раскачивая его из стороны в сторону. Чтобы зажать полоску ткани в кассете, поместите ее над кассетой, осторожно центрируя ее, чтобы пройти мимо отверстий в зажимах на обоих концах. Поместите вкладку частично в отверстие на одном конце с мелкими щипцами, аккуратно выпрямите ткань и установите вторую вкладку.
Наконец, используйте щипцы, чтобы полностью вдавить каждую вкладку, чтобы закрепить ткань. После обрезки всех сторон перенесите 100-миллиметровую тарелку, содержащую кассеты, на ламинарный вытяжку. Переложите кассеты на шестилуночные пластины, содержащие первый раствор для децеллюляризации, используя изогнутый гемостат для захвата зубчатых сторон.
Затем поместите шестилуночную пластину на орбитальный шейкер при 30 оборотах в минуту в течение 10 минут. Аспирируйте жидкость из каждой лунки, затем замените ее тремя миллилитрами второго раствора децеллюляризации на лунку. Поместите пластину на орбитальный шейкер со скоростью 30 оборотов в минуту и высиживайте в течение пяти минут.
Повторите этот процесс с каждым решением, как описано в протоколе децеллюляризации в рукописи. После окончательного промывания PBS переложите ткани на стерильные шестилуночные пластины, содержащие свежий PBS с антибиотиками и антимикотиками, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 48 часов. После стерилизации антибиотиками и антимикотиками каркасы легочной ткани можно сразу же засеять или хранить при четырех градусах Цельсия до 30 дней.
Перед использованием для культивирования инкубируйте каркасы, хранящиеся при четырех градусах Цельсия со свежим PBS и антибиотиками и антимикотиками в течение ночи при 37 градусах Цельсия в качестве дополнительной стадии стерилизации. Затем промойте каркасы стерильным PBS, пять миллилитров на лунку, три раза, в течение пяти минут каждый. Исследуйте каркасы под фазово-контрастным микроскопом с 5-кратным увеличением, чтобы выбрать ткани для посева.
Приготовьте суспензию эндотелиальных клеток в эндотелиальной среде со скоростью 5 миллионов клеток на миллилитр с достаточным количеством клеток для семени 500 000 эндотелиальных клеток на срез. Поместите автоклавные семенные ванны в 100-миллиметровую чашку Петри и аккуратно переложите ополаскиватели вверх ногами в посевные ванны. Аккуратно закрутите приготовленную клеточную суспензию, чтобы перемешать.
Затем аккуратно пипетку 100 микролитров клеток непосредственно поверх каждой ткани у основания лунок, следя за тем, чтобы не повредить ткань кончиком пипетки. Перенесите засеянные ткани в инкубатор клеточной культуры. Через 24 часа после посева эндотелиальных клеток добавьте 900 микролитров предварительно подогретой питательной среды в каждую лунку с помощью ручной пипетки, затем верните пластину в инкубатор.
После 24 часов посева клеток удалите среду и замените один миллилитр свежей эндотелиальной среды на лунку. Через 72 часа после посева эндотелиальных клеток подсчитайте AEC2s, или альвеолярные эпителиальные клетки типа II, и фибробласты с помощью гемоцитометра и приготовьте клеточную суспензию 1:1 в питательной среде AEC2 со скоростью 5 миллионов клеток на миллилитр. Пипетку из каждой посевной ванны хорошо и аккуратно закрутить подготовленную клеточную суспензию.
Пипетка 100 микролитров клеток непосредственно поверх каждой ткани у основания лунки. Перенесите засеянные ткани в инкубатор клеточной культуры. Через два часа добавьте в каждую лунку 900 микролитров предварительно подогретой питательной среды AEC2, затем верните пластину в инкубатор.
После 24 часов культивирования с AEC2s и фибробластами приготовьте 12-луночную пластину с одним миллилитром предварительно нагретой питательной среды AEC2 на каждую лунку на кассету. Пипетка 800 микролитров среды из каждого колодца посевной ванны, затем извлекает кассеты из посевной ванны и переносит их правой стороной вверх к подготовленной 12-луночной пластине, по одной кассете на лунку. Тщательно меняйте культуральную среду, используя стеклянную пипетку Пастера через день в течение желаемой продолжительности культуры.
Мониторинг степени репопуляции тканей с помощью фазово-контрастной микроскопии при 5-кратном увеличении на протяжении всего периода культивирования. H и E окрашивание тканевых каркасов показало сохранение альвеолярной архитектуры после децеллюляризации без видимых клеточных ядер. Альвеолярная ткань наблюдалась, когда децеллюляризированные внеклеточные матричные каркасы рассматривались при 5-кратном увеличении с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Большие разветвленные дыхательные пути и суда также были видны на некоторых срезах. На седьмой день культуры фазово-контрастная микроскопия показала, что картина рецеллюляризации в инженерных тканях легких эмулирует альвеолярную структуру тканей в случаях успешной репопуляции. Также была видна плохая рецеллюляризация.
Окрашивание H и E на седьмой или восьмой день показало повторное заселение альвеолярных перегородок. В стойке иммунофлуоресценции выявлены проколлагеновые альфа-1-положительные фибробласты I типа, ABCA3-положительные AEC2s, CD31-положительные эндотелиальные клетки, а также обильные SPB-положительные AEC2. Кроме того, анализ тимидина показал много распространяющихся AEC2.
Этот метод облегчил разработку стратегий для инженерии легочной ткани и позволил исследовать очереди, поддерживающие пролиферацию и дифференцировку клеток типа II в альвеоле.
