Этот протокол позволяет культивировать in vitro и прямую микроскопическую визуализацию изолированных тканей дыхательных путей во время различных процедур тканевых манипуляций, таких как деэпителизация и регенерация тканей дыхательных путей. Визуализация in situ, предложенная в этом исследовании, позволяет осуществлять быстрый и неразрушающий мониторинг просвета трахеи во время контролируемого удаления эндогенного эпителия под визуальным контролем и доставки экзогенных клеток. Биореактивная платформа с визуальным контролем и протоколы манипуляций с тканями могут быть использованы для создания биоинженерной ткани дыхательных путей для моделирования заболеваний и скрининга лекарств.
Конструкция и использование биореактора тканей дыхательных путей с поддержкой визуализации будут продемонстрированы двумя аспирантами из нашей исследовательской группы, Мохаммадом Миром и Цзявеном Ченом. Чтобы начать создание устройства визуализации in situ, вставьте трубчатую линзу в штабелируемую линзовую трубку и закрепите ее с помощью стопорного кольца. Затем установите стол объектива в сборе на научную КМОП-камеру с помощью адаптера C-mount.
Используйте программное обеспечение Micromanager для управления камерой и получения фотографий и видео. При прицеливании к объекту, расположенному в 10 метрах от камеры, регулируйте расстояние между ламповым объективом и датчиком изображения камеры до тех пор, пока на экране компьютера не будет сформировано сфокусированное изображение объекта. Затем используйте компоненты системы оптического сепаратора, такие как сборочный стержень, резьбовая пластина клетки и куб клетки, для установки фильтрующей линзы на двухгранную, дихроичное зеркало сверхвысокого разрешения и лазер к устройству.
Подключите объектив 20X к устройству. Затем установите зеленый объектив диаметром 500 микрометров на дистальном конце трубки объектива через транслятор X-Y. Отрегулируйте расстояние между зелеными линзами и объективами, чтобы сформировать сфокусированные микроскопические изображения.
Чтобы визуализировать изолированный просвет трахеи крыс в ярком поле или флуоресцентном, поместите биореактор на стадию визуализации. Затем вводят 500 микролитров свежеприготовленного карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира, или раствора CFSE, со скоростью потока пять миллилитров в минуту через трахею через шприцевой насос, соединенный с трубкой канюли трахеи. Как только раствор CFSE заполнит трахею, остановите насос.
Через 10 минут промыть просвет трахеи, влив 10 миллилитров PBS с помощью шприцевого насоса для удаления остаточных невключенных реагентов CFSE. После промывки вставьте дистальный конец зеленой линзы в трахею через разъем luer, прикрепленный к одному концу трахеи. Затем осторожно переместите зеленую линзу внутрь трахеи до тех пор, пока поверхность трахеи не будет сфокусирована.
Чтобы захватить изображения яркого поля в программном обеспечении микроменеджера, осветите просвет трахеи белым светом через куб клетки. Затем нажмите на значок Live, чтобы показать просветную поверхность трахеи в режиме реального времени. Вкладки Параметры изображения и Экспозиция используются для изменения времени экспозиции до требуемого значения.
Чтобы настроить контрастность и яркость изображений, используйте окно гистограммы и масштабирования интенсивности для перемещения черно-белых стрелок в конечную точку интерактивного отображения гистограммы. Нажмите Stop Live, чтобы активировать значок Snap, затем нажмите на значок Snap, чтобы заморозить изображение. Затем используйте настройку Экспорт, затем Изображения как перемещенные вкладки, чтобы сохранить изображения в нужном формате.
Чтобы получить фотографии и видео в флуоресцентном режиме, освещайте просвет трахеи лазерным светом CFSE через куб клетки и получайте изображения в режиме реального времени, перемещая зонд визуализации вперед и назад. Как только фотографии и видео будут получены, аккуратно снимите зеленую линзу с трахеи. Для деэпителизации трахеи закапывают 50 микролитров свежеприготовленного 2%-го додецилсульфата натрия через канюлю трахеи с образованием тонкой пленки раствора моющего средства на просвете трахеи.
После закапывания закройте соединения трубк биореактора с помощью мужских или женских пробок и перенесите биореактор в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы SDS обитал в трахее. Повторите закапывание один раз. После второй закапывания удаляют лизированный эпителий и SDS путем орошения просвета трахеи трижды 500 микролитрами PBS через шприцевой насос со скоростью потока 10 миллилитров в минуту.
Затем поместите биореактор на шейкер для механической вибрации с частотой 20 Гц и амплитудой смещения 0,3 миллиметра, чтобы физически способствовать отслоению эпителиальных клеток, обработанных SDS, от просвета трахеи. Пока трахея механически вибрирует, закапывайте 500 микролитров PBS дважды через просвет трахеи, чтобы удалить остаточный SDS и клеточный мусор. После удаления эпителия оцените клиренс эпителиального слоя, измерив интенсивность CFSE с помощью устройства визуализации зеленой линзы.
После приготовления деэпителизированной трахеи крысы разморозьте замороженные мезенхимальные стволовые клетки, или МСК, в течение 30 секунд на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Затем подсчитывают клетки гемоцитометром с последующим приготовлением клеточного раствора с концентрацией от пяти раз 10 до шести клеток на миллилитр. Затем метьте клетки флуоресцентно, инкубируя их двумя миллилитрами 100-микромолярного раствора CFSE при комнатной температуре.
Через 15 минут промыть клетки пятью миллилитрами PBS три раза, прежде чем повторно использовать их в свежей культуральной среде DMEM в конечной концентрации от трех раз 10 до семи клеток на миллилитр. Сразу после приготовления коллагена I гидрогеля, как описано в рукописи, добавляют клетки в раствор гидрогеля с нужной концентрацией. Затем смешайте клетки и раствор геля с микропипеткой для получения однородной клеточно-гидрогелевой смеси.
Затем присоедините один конец трахеи внутри биореактора к программируемому шприцевому насосу через соединитель luer и доставьте пять миллилитров свежей питательной среды в камеру биореактора при 37 градусах Цельсия, чтобы покрыть внешнюю поверхность трахеи. Затем вводят 10 микролитров болюса клеточно-гидрогелевой смеси в деэпителизированную трахею внутри биореактора для создания клеточно-гидрогелевого слоя на просвете трахеи. После инъекции клетки поместите биореактор в инкубатор стерильной клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа для геллации в течение 30 минут, чтобы обеспечить гелляцию.
Чтобы визуализировать распределение имплантированных клеток, стерилизуйте зеленую линзу 70% изопропиловым спиртом или этанолом и поместите биореактор на стадию визуализации для получения фотографий и видео как в ярко-полевом, так и в флуоресцентном режимах. После 30 минут посева клеток вводят один миллилитр питательной среды в просвет трахеи со скоростью потока один миллилитр в минуту. Наконец, культивируйте клеточную трахею внутри биореактора в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение желаемого времени.
Во время клеточной культуры держите среду внутри просвета статичной, в то время как среда вне трахеи непрерывно перфузируется однонаправленным потоком. На ярко-полевых и флуоресцентных изображениях деэпителизированной трахеи до маркировки CFSE флуоресцентный сигнал не наблюдался. При CFSE во всем эпителии наблюдался равномерный флуоресцентный сигнал.
После деэпителизации интенсивность флуоресцентности значительно снизилась, что свидетельствует об абляции эпителия. Окрашивание гематоксилином и эозином деэпителизированной трахеи проиллюстрировало удаление псевдостратифицированного эпителия из просвета трахеи и сохранение клеток и внеклеточного матрикса, или микроструктур ECM, в нижележащих слоях ткани. Кроме того, окрашивание пентахромом и трихромом подтвердило сохранение архитектуры ткани трахеи и компонентов ECM, таких как коллаген и протеогликаны.
Иммунофлуоресценция эпителиальных клеток и коллагена I выявила полное удаление эпителия и сохранение коллагена I в субэпителиальной ткани. Сканирующие электронные микроснимки показали, что нативная трахея была заселена мультициллированными и бокалевыми клетками. В деэпителиализованной трахее обнажали базальную мембрану, о чем свидетельствует сетка из волокон внеклеточного матрикса и отсутствие эпителиальных клеток.
Флуоресцентные изображения деэпителизированной трахеи при посеве PBS и коллагеном показаны здесь. По сравнению с клетками, посеянными через культуральную среду, флуоресцентно меченые клетки, доставленные через гидрогель, оставались более равномерно приклеенными по всему просвету. Исследование жизнеспособности клеток показало, что процедура доставки клеток не влияет на жизнеспособность, и более 90% клеток остаются жизнеспособными.
Создание тонкой пленки моющего средства в процессе деэпителизации и использование гидрогеля в качестве средства доставки для клеток являются важными шагами для успеха этого протокола. Нашей следующей целью исследования является имплантация выращенных в лаборатории первичных или стволовых клеток дыхательных путей в деэпителиализованную ткань дыхательных путей, чтобы выяснить, можно ли подготовить функциональную ткань дыхательных путей.
