В нашем исследовании используются оптогенетические инструменты для изучения того, как нейронные цепи у Drosophila melanogaster управляют поведением, таким как термотаксис и беременность. Управляя определенными нейронами с помощью света, мы стремимся понять, как эти цепи управляют сенсорными реакциями и влияют на принятие решений с высокой точностью. Оптогенетика — это ценная технология в нейробиологии, обеспечивающая точное управление нейронной активностью с помощью света.
У Drosophila melanogaster такие инструменты, как CsChrimson и GtACR2, обеспечивают целенаправленную активацию и ингибирование нейронов. Эти инструменты позволяют исследователям манипулировать нейронными цепями, изучать поведение и исследовать реакции датчиков с высокой специфичностью. Наш протокол предлагает простой, экономически эффективный и воспроизводимый подход к оптогенетическим манипуляциям у дрозофил.
В нем используются коммерчески доступные материалы, что делает его доступным в лабораториях и классах с ограниченными ресурсами. Методы также обладают высокой адаптивностью, что позволяет изучать привлекательное поведение и поведение избегания с минимальными техническими проблемами. Для начала приобретите самцов и самок мух дрозофил, экспрессирующих GtACR2 в нагревательных элементах.
Совместите две стальные пластины на отдельных конфорках так, чтобы их края встретились. Сверху поместите протектор из пластикового листа и закрепите его скотчем, чтобы свести к минимуму движение. Теперь положите лист белой бумаги на защитную пленку листа, чтобы уменьшить сигналы фонового шума, и поместите прозрачную пластиковую крышку поверх белой бумаги.
Затем прорежьте отверстие в дне коробки из пенополистирола, чтобы разместить камеру и синий свет примерно в 12 сантиметрах над экспериментальной поверхностью. Расположите камеру и синий свет так, чтобы свести к минимуму блики, обеспечив при этом активацию. Настройте камеру на запись с интервалом в одну секунду, узким полем и разрешением 4 000 x 3 000 пикселей.
Отрегулируйте настройки конфорки так, чтобы поддерживать температуру поверхности 25 плюс-минус один градус Цельсия и 31 плюс-минус один градус Цельсия на соответствующих стальных пластинах. Контролируйте температуру стальных пластин с помощью поверхностного датчика температуры до и после каждого испытания. Затем поместите пластиковую крышку на стальную пластину с температурой 25 градусов Цельсия.
Теперь с помощью аспиратора от мух аккуратно выпустите одну муху под крышкой. Расположите коробку над экспериментальной зоной, чтобы создать тусклый свет ниже 10 люкс, и дайте мухе акклиматизироваться в течение одной минуты. После периода акклиматизации поднимите коробку и быстро отрегулируйте пластиковую крышку так, чтобы центр крышки совпал с границей стальной пластины.
Инициируйте испытание, включите камеру и синий свет на 20 килолюкс. Фиксируйте активность мух в течение двух минут. Через две минуты выключите камеру и свет.
Избавьтесь от мух с помощью аспиратора. Обезболить истощенных самцов и самок мух, экспрессирующих CsChrimson в нейронах рецепторов сладкого вкуса на льду. Нанесите от семи до 10 небольших точек клея на предметное стекло.
Расположите по одной брюшной стороной мухи вверх на каждой точке клея, следя за тем, чтобы грудная клетка и крылья контактировали с клеем, чтобы свести к минимуму движение. Разверните крылья веером в каждую сторону, чтобы увеличить площадь клейкой поверхности. Поместите влажные бумажные полотенца в коробку с влажностью и переложите слайды в коробку.
Через два часа восстановления поместите предметное стекло под микроскоп. Используйте шприц, чтобы накачать каплю воды, чтобы насытить мух, предотвращая вызванное жаждой расширение хоботка. Вручную держите красную лазерную указку и посветите красным светом на хоботок или голову одиночной мухи при 700 люкс.
Наблюдайте за реакцией на расширение хоботка через микроскоп в течение 30-секундного окна. После тестирования индуцированного светом расширения хоботка исследуйте реакцию на 4% сахарозу. Вытолкните каплю сахарозы на конец иглы шприца и поднесите ее близко к хоботку мухи.
Во-первых, соберите лабиринт из мух для эксперимента. В темное время суток или при слабом освещении поместите 10 самцов и 10 самок, экспрессирующих CsChrimson, в загрузочную трубу и подсоедините ее к камере выдержки. Наклоните элеватор и осторожно постучайте по трубке, чтобы переместить мух в камеру хранения.
После переноса мух в камеру выдержки с помощью элеватора опустите их между загрузочной трубой и отверстиями испытательной трубы. Затем снимите загрузочную трубку. Расположите лабиринт от мух на расстоянии примерно 13 сантиметров от источника красного света мощностью 1000 миллиампер, не включая свет.
Опустите элеватор до тех пор, пока камера выдержки не совпадет с отверстиями в пробирках, что позволит мухам свободно перемещаться между пробирками, обернутыми фольгой, и открытыми пробирками. Одновременно включите красный свет на скорости около 40 килолюкс, чтобы активировать CsChrimson. Позвольте мухам в течение минуты выбирать между трубкой, подверженной воздействию красного света, и затененной трубкой.
Через минуту поднимите элеватор между загрузочной трубой и отверстиями в испытательной трубе. Удалите мух из каждой трубки. Посчитайте их и запишите цифры.
Очищайте лифт и лабиринт для полетов с помощью дистиллированной воды после каждого испытания. В оптогенетическом, термотаксическом, позиционном анализе голубого света мухи избегали температуры 31 градус Цельсия в контрольных условиях, в то время как в синем свете с добавкой ATR мухи не проявляли предпочтения между 25 и 31 градусами Цельсия, что указывает на ингибирование нейронов HC через активацию GtACR2. В контрольных условиях мухи показали минимальную реакцию на удлинение хоботка, в то время как активация красным светом с добавкой ATR привела к значительному удлинению хоботка, демонстрируя активацию чувствительных к сладости нейронов с помощью CsChrimson.
В оптогенетическом анализе лабиринта мух контрольные группы не показали никаких предпочтений, в то время как активация красным светом с добавкой ATR заставляла мух избегать открытой трубки, что указывает на активацию горьких нейронов CsChrimson.
