Nossa pesquisa usa ferramentas optogenéticas para estudar como os circuitos neurais em Drosophila melanogaster governam comportamentos, como termotaxia e gestação. Ao controlar neurônios específicos com luz, pretendemos entender como esses circuitos impulsionam as respostas sensoriais e influenciam a tomada de decisões com alta precisão. A optogenética é uma tecnologia valiosa em neurociência, oferecendo controle preciso da atividade neural usando a luz.
Em Drosophila melanogaster, ferramentas como CsChrimson e GtACR2 permitem a ativação e inibição direcionadas de neurônios. Essas ferramentas permitem que os pesquisadores manipulem circuitos neurais, estudem o comportamento e explorem as respostas dos sensores com alta especificidade. Nosso protocolo oferece uma abordagem simples, econômica e reprodutível para a manipulação optogenética em Drosophila.
Ele usa materiais disponíveis comercialmente, tornando-o acessível em laboratórios e salas de aula com recursos limitados. Os métodos também são altamente adaptáveis, permitindo o estudo de comportamentos atraentes e de evitação com desafios técnicos mínimos. Para começar, obtenha moscas Drosophila machos e fêmeas, expressando GtACR2 em células de aquecimento.
Alinhe duas placas de aço em placas de aquecimento separadas para que suas bordas se encontrem. Coloque um protetor de folha de plástico em cima e prenda-o com fita adesiva para minimizar o movimento. Agora, posicione um pedaço de papel branco no protetor de folha para reduzir os sinais de ruído de fundo e coloque uma tampa de plástico transparente em cima do papel branco.
Em seguida, faça um furo no fundo de uma caixa de espuma de poliestireno para acomodar a câmera e a luz azul aproximadamente 12 centímetros acima da superfície experimental. Posicione a câmera e a luz azul para minimizar o brilho, garantindo a ativação. Configure a câmera para gravar com um lapso de tempo de um segundo, campo estreito e uma resolução de 4.000 por 3.000 pixels.
Ajuste as configurações da placa de aquecimento para manter uma temperatura de superfície de 25 mais ou menos um grau Celsius e 31 mais ou menos um grau Celsius nas respectivas placas de aço. Monitore as temperaturas das chapas de aço usando uma sonda de temperatura da superfície antes e depois de cada teste. Em seguida, coloque a tampa plástica na placa de aço de 25 graus Celsius.
Agora, usando um aspirador de moscas, solte suavemente uma única mosca sob a cobertura. Posicione a caixa acima da área experimental para criar uma luz fraca abaixo de 10 lux e deixe a mosca se aclimatar por um minuto. Após o período de aclimatação, levante a caixa e ajuste rapidamente a tampa plástica para que o centro da tampa fique alinhado com o limite da chapa de aço.
Inicie o teste, ligue a câmera e a luz azul a 20 quilolux. Capture a atividade das moscas por dois minutos. Após dois minutos, desligue a câmera e a luz.
Descarte as moscas usando o aspirador. Anestesie moscas machos e fêmeas famintas que expressam CsChrimson em neurônios receptores de sabor doce no gelo. Aplique de sete a 10 pequenos pontos de cola em uma lâmina de vidro.
Posicione uma mosca com o lado ventral voltado para cima em cada ponto de cola, garantindo que o tórax e as asas entrem em contato com a cola para minimizar o movimento. Espalhe as asas para cada lado para aumentar a área da superfície adesiva. Coloque toalhas de papel molhadas em uma caixa de umidade e transfira as lâminas para a caixa.
Após duas horas de recuperação, coloque a lâmina sob o microscópio. Use uma seringa para fornecer uma gota de água para saciar as moscas, evitando extensões de tromba induzidas pela sede. Segure manualmente um ponteiro laser vermelho e acenda a luz vermelha na tromba ou na cabeça de uma única mosca a 700 lux.
Observe a resposta de extensão da tromba através do microscópio dentro de uma janela de 30 segundos. Depois de testar a extensão da probóscide induzida pela luz, examine a resposta à sacarose a 4%. Expulse uma gota de sacarose na ponta da agulha da seringa e aproxime-a da tromba da mosca.
Primeiro, monte o labirinto de moscas para o experimento. Em condições de pouca luz, coloque 10 moscas machos e 10 fêmeas que expressam CsChrimson no tubo de carregamento e conecte-o à câmara de retenção. Incline o elevador e bata suavemente no tubo para mover as moscas para a câmara de retenção.
Depois de transferir as moscas para a câmara de retenção, use o elevador para baixá-las entre o tubo de carregamento e os orifícios do tubo de teste. Em seguida, remova o tubo de carregamento. Posicione o labirinto de moscas a aproximadamente 13 centímetros de distância da fonte de luz vermelha de 1.000 miliamperes sem acender a luz.
Abaixe o elevador até que a câmara de retenção se alinhe com os orifícios do tubo de teste, permitindo que as moscas se movam livremente entre os tubos de teste envoltos em papel alumínio e descobertos. Simultaneamente, acenda a luz vermelha a aproximadamente 40 quilolux para ativar o CsChrimson. Deixe as moscas escolherem entre o tubo exposto à luz vermelha e o tubo sombreado por um minuto.
Após um minuto, levante o elevador entre o tubo de carregamento e os orifícios do tubo de teste. Remova as moscas de cada tubo. Conte-os e registre os números.
Limpe o elevador e o labirinto usando água destilada após cada teste. No ensaio de preferência posicional, optogenética, termotática e de luz azul, as moscas evitaram o lado de 31 graus Celsius sob as condições de controle, enquanto na luz azul com suplementação de ATR, as moscas não exibiram preferência entre 25 e 31 graus Celsius, indicando inibição do neurônio HC via ativação de GtACR2. Sob condições de controle, as moscas mostraram resposta mínima de extensão de tromba, enquanto a ativação da luz vermelha com suplementação de ATR resultou em extensão significativa de tromba, demonstrando a ativação de neurônios sensíveis por CsChrimson.
No ensaio de labirinto de moscas optogenéticas de luz vermelha, os grupos de controle não mostraram preferência, enquanto a ativação da luz vermelha com suplementação de ATR fez com que as moscas evitassem o tubo descoberto, indicando ativação de neurônios sensíveis amargos por CsChrimson.
