우리의 연구는 광유전학 도구를 사용하여 Drosophila melanogaster의 신경 회로가 열택시 및 임신과 같은 행동을 어떻게 지배하는지 연구합니다. 빛으로 특정 뉴런을 제어함으로써 이러한 회로가 어떻게 감각 반응을 유도하고 높은 정밀도로 의사 결정에 영향을 미치는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 광유전학은 신경과학에서 중요한 기술로, 빛을 사용하여 신경 활동을 정밀하게 제어할 수 있습니다.
Drosophila melanogaster에서 CsChrimson 및 GtACR2와 같은 도구는 뉴런의 표적 활성화 및 억제를 가능하게 합니다. 이러한 도구를 통해 연구원들은 신경 회로를 조작하고, 행동을 연구하고, 높은 특이성으로 센서 반응을 탐색할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 초파리의 광유전학적 조작에 대한 간단하고 비용 효율적이며 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다.
상업적으로 이용 가능한 자료를 사용하여 리소스가 제한된 실험실과 교실에서 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 또한 적응력이 뛰어나 최소한의 기술적 문제로 매력 및 회피 행동을 연구할 수 있습니다. 시작하려면 발열 세포에서 GtACR2를 발현하는 수컷 및 암컷 초파리 파리를 얻습니다.
두 개의 강판을 별도의 핫플레이트에 정렬하여 가장자리가 만나도록 합니다. 그 위에 플라스틱 시트 보호대를 놓고 테이프로 고정하여 움직임을 최소화합니다. 이제 시트 보호기에 흰 종이 한 장을 올려 배경 잡음 신호를 줄이고 흰 종이 위에 투명한 플라스틱 덮개를 놓습니다.
그런 다음 폴리스티렌 폼 상자 바닥에 구멍을 뚫어 실험 표면에서 약 12cm 위에 카메라와 청색광을 수용할 수 있도록 합니다. 카메라와 블루라이트를 배치하여 눈부심을 최소화하는 동시에 활성화를 보장합니다. 1초 타임랩스, 좁은 필드 및 4, 000 x 3, 000 픽셀의 해상도로 녹화하도록 카메라를 설정합니다.
각 강판의 표면 온도를 섭씨 25도 플러스 또는 마이너스 1도, 섭씨 31도 플러스 또는 마이너스 1도로 유지하도록 핫플레이트 설정을 조정합니다. 각 시험 전후에 표면 온도 프로브를 사용하여 강판의 온도를 모니터링하십시오. 그런 다음 섭씨 25도의 강판에 플라스틱 덮개를 놓습니다.
이제 파리 흡입기를 사용하여 덮개 아래에 있는 파리 한 마리를 부드럽게 풀어줍니다. 실험 영역 위에 상자를 배치하여 10lux 미만의 희미한 빛을 만들고 파리가 1분 동안 적응하도록 합니다. 적응 기간이 끝나면 상자를 들어 올리고 플라스틱 덮개를 빠르게 조정하여 덮개의 중심이 강판 경계와 정렬되도록 합니다.
평가판을 시작하고 카메라를 켜고 20킬로럭스에서 블루라이트를 켭니다. 2분 동안 파리의 활동을 캡처합니다. 2분 후 카메라와 조명을 끕니다.
흡인기로 파리를 처분하십시오. 굶주린 수컷과 암컷 파리를 마취시켜 얼음 위의 단맛 수용체 뉴런에서 CsChrimson을 발현합니다. 유리 슬라이드에 7-10개의 작은 접착제 점을 바르십시오.
각 접착제 점에 한쪽 플라이 복부 쪽이 위로 향하게 배치하여 흉부와 날개가 접착제에 닿도록 하여 움직임을 최소화합니다. 날개를 양쪽으로 부채질하여 접착 표면적을 늘립니다. 젖은 종이 타월을 습도 상자에 넣고 슬라이드를 상자로 옮깁니다.
2시간의 회복 후 슬라이드를 현미경 아래에 놓습니다. 주사기를 사용하여 물방울을 전달하여 파리를 포만하게 하고 갈증으로 인한 확장을 방지합니다. 수동으로 빨간색 레이저 포인터를 잡고 700lux에서 단일 파리의 또는 머리에 빨간 빛을 비춥니다.
30초 이내에 현미경을 통해 확장 반응을 관찰합니다. 광유도 확장을 테스트한 후 4%자당에 대한 반응을 검사합니다. 주사기 바늘 끝에 있는 자당 한 방울을 빼내고 파리의 주둥이에 가까이 가져갑니다.
먼저 실험을 위해 파리 미로를 조립합니다. 어둡거나 저조도 조건에서는 10마리의 수컷 CsChrimson 발현 파리와 10마리의 암컷 CsChrimson 발현 파리를 로딩 튜브에 넣고 홀딩 챔버에 연결합니다. 엘리베이터를 기울이고 튜브를 부드럽게 두드려 파리를 수용실로 이동시킵니다.
파리를 홀딩 챔버로 옮긴 후 엘리베이터를 사용하여 로딩 튜브와 테스트 튜브 구멍 사이로 파리를 내립니다. 그런 다음 로딩 튜브를 제거합니다. 조명을 켜지 않고 13, 000밀리암페어 빨간색 광원에서 약 1cm 떨어진 곳에 파리 미로를 배치합니다.
홀딩 챔버가 시험관 구멍과 정렬될 때까지 엘리베이터를 내려 파리가 호일로 감싼 시험관과 덮개가 없는 시험관 사이를 자유롭게 이동할 수 있도록 합니다. 동시에 약 40킬로럭스에서 빨간색 표시등을 켜서 CsChrimson을 활성화합니다. 파리가 1분 동안 빨간색광에 노출된 튜브와 음영 처리된 튜브 중에서 선택하도록 합니다.
1분 후 적재 튜브와 테스트 튜브 구멍 사이의 엘리베이터를 올립니다. 각 튜브에서 파리를 제거합니다. 그것들을 세고 숫자를 기록하십시오.
각 시도 후에 증류수를 사용하여 플라이 엘리베이터와 플라이 미로를 청소하십시오. 청색광, 광유전학, 열택성, 위치 선호 분석에서 파리는 대조 조건에서 섭씨 31도 쪽을 피한 반면, ATR 보충이 있는 청색광에서 파리는 섭씨 25도에서 31도 사이에서 선호하지 않았으며, 이는 GtACR2 활성화를 통한 HC 뉴런 억제를 나타냅니다. 대조군 조건에서 파리는 최소한의 확장 반응을 보인 반면, ATR 보충으로 적색광 활성화는 상당한 확장을 초래하여 CsChrimson에 의한 단맛 감지 뉴런의 활성화를 보여주었습니다.
적색광, 광유전학, 파리 미로 분석에서 대조군은 선호하지 않은 반면, ATR 보충으로 적색광 활성화는 파리가 덮개가 없는 튜브를 피하게 하여 CsChrimson에 의한 쓴 감지 뉴런 활성화를 나타냅니다.
