Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

Summary

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמיה של המיטוכונדריה לחיות הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי פני משכי זמן ארוכים. הדמיה על תקופות ממושכות נעשה באמצעות הביטוי lentivirus בתיווך של חלבון פלואורסצנטי ממוקד mitochondrially ושימוש זול הבמה העליון חממה כי תוכנן ונבנה במעבדה שלנו.

Abstract

כדי להבין את הקשר בין תחבורה המיטוכונדריה ותפקוד עצבי, חיוני לבחון התנהגות המיטוכונדריה בנוירונים בתרבית לחיות המשכים המורחבת ^1-3. עכשיו זה אפשרי באמצעות צבעים חיוניים חלבוני ניאון עם אילו רכיבים cytoskeletal, האברונים, ומבנים אחרים בתאים חיים יכול להיות מתויג, ואז דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי דינמי. כך למשל, הנוירונים עוף עובריים אוהד, תנועה המיטוכונדריה התאפיינה באמצעות rhodamine חיוני לצבוע 123 ^4. במחקר אחר, המיטוכונדריה היו דמיינו בנוירונים forebrain עכברוש ידי transfection של eYFP ממוקד mitochondrially ^5. עם זאת, הדמיה של נוירונים העיקרי על דקות, שעות, ימים או אפילו מציג מספר סוגיות. הבולטים הללו הם: 1) קיום התנאים תרבות כגון טמפרטורה, לחות pH במהלך הפגישות הדמיה רב; 2) איתות חזק, יציב ניאון כדי להבטיח הן את איכות התמונות רכשה מדידה מדויקת של עוצמת האות במהלך ניתוח התמונה; ו 3) להגביל את החשיפה פעמים במהלך הרכישה התמונה כדי למזער photobleaching ולהימנע phototoxicity.

כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר תצפית, ויזואליזציה, וניתוח של התנועה המיטוכונדריה נוירונים בהיפוקמפוס תרבותי עם רזולוציה גבוהה הזמני בתנאים אופטימליים תמיכה החיים. בנינו סביר בשלב העליונה חממה המספק ויסות טמפרטורה טובה זרימת הגז באטמוספירה, וגם מגביל את מידת התאדות התקשורת, והבטיח pH osmolarity יציבה. בחממה זו קשורה, דרך כניסת וצינורות לשקע, לתרבות תקן רקמות החממה, אשר מספק רמות לחות קבוע אווירה של 5-10% CO ₂ / אוויר. עיצוב זה מציע חלופה חסכונית חממות מיקרוסקופ באופן משמעותי יותר יקר, כי לא בהכרח להבטיח את יכולת הקיום של תאים על פני שעות רבות ואפילו ימים. כדי להמחיש את המיטוכונדריה, אנו להדביק תאים עם lentivirus קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום כי הוא ממוקד mitochondrion. זה מבטיח איתות חזק ומתמשך, אשר, יחד עם שימוש של מקור אור קסנון יציב, מאפשר לנו להגביל את החשיפה פעמים במהלך הרכישה תמונה וכל אלא מונע photobleaching ו phototoxicity. שתי יציאות הזרקה על החלק העליון של השלב העליון, החממה לאפשר לממשל חריפה של נוירוטרנסמיטורים ריאגנטים אחרים שנועדו לווסת את תנועת המיטוכונדריה. בביטוי, lentivirus בתיווך סכום של חלבון אברון במיקוד ניאון אדום שילוב של חממה הבמה העליון שלנו, מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי הפוכה, מצלמת CCD, ומקור אור קסנון לאפשר לנו לרכוש זמן לשגות תמונות של תחבורה המיטוכונדריה נוירונים חיים על פני משכי זמן ארוכים מאלה אפשרי במחקרים פריסת צבעים חיוניים קונבנציונאלי-off-המדף מערכות תומכות חיים.

Protocol

1. תיאור מעבדה בנוי שלב העליונה החממה

שמירה על תאים חיים על הבמה מיקרוסקופ עבור משכי המורחבת מציעה שלושה אתגרים מרכזיים: 1) בקרת טמפרטורה תקנה הסביבה; 2) בקרת לחות, כלומר, שמירה על תכולת הלחות של האטמוספרה הסביבה; ו 3) שמירה על pH מתאים במדיום תרבות. בעיות אלה "חיי התמיכה" הם קריטיים עבור ניסויים מעורבים תצפית ארוכת טווח של נוירונים בתרבית, תאים רגישים במיוחד לשינויים בטמפרטורה ו-PH. בהמשך, אנו מתארים פשוטה במעבדה בנוי הבמה העליון החממה שאנו תוכנן ונבנה עבור הדמיה חיה של נוירונים על פני משכי זמן ממושך. בחממה זו מחוברת, באמצעות במעגל סגור, לתרבות תקן רקמות חממה (Thermo Scientific, Asheville, NC), אשר מספק יציבות מחוממת (37 מעלות צלזיוס), האווירה humidified של 10% CO באוויר ₂ / 90%.

1. החממה המתחם: גופתו של החממה (איור 1 (I, II);) היה מפוברק על מכונה C & C ממוחשב טחינה מחתיכת פלסטיק מוצקה delrin שחור. הוא מודד 97.74mm (L) x 73.60mm (רוחב) x 28.58mm (H), (מידות פנימיות של 96.74mm x 72.60mm x 27.58mm) מתן נפח סגורה של ³ ס"מ בערך 19,370. שני חורים שנקדחו בכל צד של המתחם מצויד עקיצות פליז הליכי כדי להתאים לשקע כניסת ואת צינורות מ / אל בתרבית רקמה חממה. פתח מלבני מדידה 70.0mm x 43.0mm היה התגודדו מחוץ בחלק העליון של המתחם כדי לאפשר מיקום של חלון פלסטיק פוליקרבונט (איור 1 (I, II); B). הבסיס של החממה (איור 1 (I, II, III); C; צפה בפרופיל העליון מוצג בפירוט למעלה משמאל), הסתובבו ממלאי "3 / 16 אלומיניום, באמצעים 159.77mm (L) x 109.86mm (W ) x 3.175mm (ד), והוא מיועד להשתלב ההפסקה להכניס ממונע של לייקה 3-צלחת הבמה (דגם 11-522-068, לייקה GmbH, לייפציג, גרמניה). ארבעה עמודי פלדה עם הנושאים הפנימיים צורפו . בפינות thebase ידי סומק רכוב שטוח ראש ברגים אלה מספקים נקודות מצורף מוצק המתחם החממה, אשר כבר קדחו בחוץ בכל פינה כדי לקבל את ההודעות (איור 1 (II, III); ד). אטם sorbothane (מקמאסטר קאר בע"מ, Elmhurst, IL) היה לחתוך מצויד לבסיס לספק חותם על הממשק המתחם / לבסיס. ארבעה thumbscrews פליז עם השחלה ההתאמה של ההודעות משמשים כדי לאבטח את המתחם לבסיס (איור 1 (II, III). D) חור בקוטר 35.1mm עם שפה הפסקה דק נחתך במרכזו של בסיס חממה כדי להתאים GBMs 35mm (איור 1 (III); E; פרט בצד שמאל למעלה); בסיסים נוספים עוצבו כדי להתאים את המנה בגדלים אחרים בתרבות.
2. גופי חימום: שני 10 Kohm מפזר החום נגדים (Digi-Key קורפ, Thief River Falls, MN) הם מודבקת על הקירות הפנימיים של המתחם החממה. אלה חוטית DC 9V, שנאי 500mA כי הוא פקוק לתוך בקר 1000W Alife חממה והטמפרטורה (קרוליינה אספקה ​​חיות מחמד, Irmo, SC). בדיקה קווית להציב דרך אטם בחלון פוליקרבונט של המתחם חממה מזהה טמפרטורת הסביבה הפנימית קובע זרימת הנוכחי של נגדים. יחד עם התרבות רקמות חממה, נגדים לספק אמצעי נוסף של בקרת טמפרטורת הסביבה.
3. במעגל סגור האווירה מערכת: כדי לספק אווירה humidified ומחוממת מתמדת של אוויר CO 10% ₂ / 90%, הבמה העליון חממה מחובר, דרך כניסת וצינורות לשקע (איור 1 (אני); F, G), כדי תקן, המים במעיל בתרבית רקמה חממה (איור 1 (אני); H); פורמה דגם 3154 מדעי: Thermo Scientific, Inc, Asheville, NC). רק לפני ההתחברות שלב העליונה חממה, צינור כניסת (איור 1 (אני); F) נתקל משאבת אקווריום סטנדרטי (איור 1 (אני); אני; Lifegard QuietOne דגם 1200, Pentair Aquatics, באל מונטה, קליפורניה) כי כבר סגורים בתוך קופסה סגורה מפלסטיק ABS (איור 1 (אני); J, דגם 1150, מוצרים שקנאי, Inc, טורנס, CA) כדי לשמור על במעגל סגור. משאבת זה מעודד זרימת אוויר רציפה מן התרבות רקמות חממה על הבמה למעלה בחממה. לאחר שלב משאבה, צינור כניסת רץ בקבוק Erlenmeyer 1500ml (איור 1 (אני); K) שפועל צעיף כדי למזער העברת רטט מהמשאבה על הבמה למעלה בחממה. צינור מוצא (איור 1 (אני); G) מובילים את הבמה העליונה חממה על תרביות רקמה חממה (איור 1 (אני); H) מצויד מאוורר המחשב סגור (איור 1 (אני); L), אשר, כמו המשאבה, נועד גם לקדם את זרימת אוויר רציפה.
4. PFTE מכסה קרום עבור 35mm GBM: לפני הצבת תרבות העצבית השלב העליונה חממה הדמיה, GBM 35mm מצויד מיוחד ליmbrane מכסה (איור 1 (II, IV); M, פרט מופיע בצד ימין למעלה) כדי לאפשר חילופי גזים באותו הזמן לצמצם את התאדות של המדיום לתרבות. מכסה זו מורכבת שפת פלסטיק delrin וגיליון מראש לחתוך PFTE של הממברנה (טפלון, אמריקאי Durafilm ושות' בע"מ, Holliston MA) כי כבר נמתח מעל שפת והחזיק במקום עם אטם Viton כי מחליק לתוך ערוץ הפסקה בצד של שולי הפלסטיק delrin.
5. יציאות הזרקה: שני חורים שנקדחו לתוך חלון פוליקרבונט (איור 1 (II), פרט למרכז, חיצים צהובים ליד ב ') על הבמה למעלה בחממה. אלה היו מצוידים נירוסטה המילטון מזרק מסתיים לספק יציאות הזרקה לניהול 5-HT, התובע, אגוניסטים לקולטן שונים היריבים, ו ריאגנטים אחרים במהלך הניסוי נתון.

2. הכנת תרבויות בהיפוקמפוס ראשי

כל העבודה מתבצעת גם ברדס BSL2 זרימה למינרית או ספסל זרימה למינרית. נוירונים בהיפוקמפוס ראשיים הם מבודדים E18 עוברי חולדה על פי נהלים קבועים ^6-7, והם מגדלים בינוני בסרום חופשי כי כבר מותנה האסטרוציטים קורטיקלי ראשוני. ותאי גלייה ערוכים לפי שיטות שפורסם ^7. בינוני מותנה מורכב DMEM הגלוקוז נמוכה, בתוספת פרולין (1.76 UG / ml), asparagine (0.83 UG / ml), ויטמין B12 (0.34 UG / ml), גלוקוז (20mm), שומנים עשירים BSA (0.5 מ"ג / מ"ל ) ו - 2% B27 ^8-10. אנטיביוטיקה לא מתווספים המדיום כפי שהם עלולים להפריע שעתוק הגנים עצביים.

1. מכסים את הכוס מרכזי coverslip חלק צלחת זכוכית התחתונה 35mm תרבות (GBM) עם פולי-D-ליזין (0.05 מ"ג / מ"ל ​​PBS), ולהשאיר עומד שעתיים ב 37 ° C. לשאוב את הפתרון poly-D-ליזין, לאפשר לו להתייבש במשך 20 דקות בתוך ברדס זרימה למינרית BSL2. מכסים את החלק poly-D-ליזין מצופה coverslip של GBM עם laminin (0.01 מ"ג / מ"ל ​​PBS), ולהשאיר למשך תקופה מינימלית של 40 דקות לפני הסרת פתרון laminin עודף. מניחים בצד למשך 20 דקות.
2. לנתח hippocampi מן המוח של עוברי העכברים E18 ו לנתק אותם כמתואר הפרוטוקולים נוכחי Neuroscience ^6.
3. מדולל תאים ניתק לתוך מדיום הגידול כדי לאפשר צפיפות של 110,000 תאים לכל GBM. חשב את הריכוז הדרוש של תאים לערבב המאסטר שלכם לפי מספר GBMs תהיה הכנת.
4. המקום seeded GBMs ב ​​טמפרטורה להגדיר אתא החממה של 37 ° C ו תערובת אווירה של CO 10% אוויר ₂ / 90%.
5. שלושה עד חמישה ימים לאחר מכן, בהתאם לתנאי גידול של נוירונים, מוסיפים arabinoside C (0.14 ng / ml) לתרבויות לדכא התפשטות גליה.
6. אפשר תרבויות לגדול במשך שבועיים לפני הדבקה עם lentivirus. במהלך תקופה זו, להחליף שליש נפח בינוני GBM עם כל מדיום חדש כל שלושה ימים. לא יעלה על סכום זה של התקשורת, מכיוון שהדבר עלול להוביל הלם אוסמוטי ומוות התא.

3. הכנת קידוד חלבון רקומביננטי Lentivirus פלורסנט האדום

עבור החוקרים שאין להם גישה למתקנים לייצור lentiviruses רקומביננטי, ייצור מותאמים אישית על ידי ישות מסחרית כגון מערכת Biosciences (Mountain View, CA) היא אופציה.

Mitochondrially במיקוד חלבון פלואורסצנטי אדום גן (MitoTurboRFP; Axxora LLC, בסן דייגו, קליפורניה) מוכנס לתוך וירוס רקומביננטי עצמית inactivating הכשל החיסוני של חתולים בשליטת תעתיק של משפר מן האמרגן הגדולות ציטומגלווירוס מיידית הגן מוקדם ^11. Lentiviruses רקומביננטי מיוצרים על ידי תאים transiently transfecting 293T.

1. 293T פלייט תאים בצפיפות של ~ 75,000 תאים / ² ס"מ, למחרת, שיתוף transfect תאים עם פלסמידים קידוד וקטור ויראלי רקומביננטי, איסור פרסום FIV וגנים pol, ואת וירוס שלפוחי stomatitis G הגן גליקופרוטאין, באמצעות PolyJet (SignaGen מעבדות, Gaithersburg, MD). סך של UG 12 של ה-DNA (4.8 מיקרוגרם וקטור ויראלי, 4.8 מיקרוגרם gagpol פלסמיד, ו -2.4 מיקרוגרם VSV G הפלסמיד) משמש עבור כל צלחת 10 ס"מ התרבות של תאים 293T.
2. לאחר 24 שעות, לשאוב את המדיום התרבות תאים לשטוף בתמיסת פנול הנקס אדום ללא מלח מאוזנת כדי להסיר שאריות DNA. הוסף 10 מ"ל של מדיום סרום ללא הבסיס העצבי בתוספת 50μg/ml שומנים עשירים BSA ו Glutamax.
3. למחרת, הקציר supernatant, מסנן דרך מסנן 0.2 מיקרון נמוך חלבון מחייב להוסיף יחידה 20 polyethersulfone ultrafiltration Vivaspin (סארטוריוס, קונקורד, ארה"ב). טרום לטפל על ידי יחידת Vivaspin ברצף כביסה עם אתנול 70%, בתרבית רקמה מים כיתה ו פוספט שנאגרו מלוחים. לרכז את נגיף המכיל supernatant ~ של פי 50 על ידי צנטריפוגה ב 1500xg במשך 30 דקות. Aliquot וירוס הכנה חנות N נוזלי ₂.
4. להעריך את כמות הנגיף על ידי הדבקה של תאים B104 עכברוש עם aliquot של נגיף מרוכז ומדידת ביטוי חלבון פלואורסצנטי ידי cytometry הזרימה 72 שעות מאוחר יותר. אחוז התאים החיוביים מספק אומדן של סכום של נפח וירוס כלומר הנגיף מרוכז צריך לקבל ביטוי חלבון פלואורסצנטי מספר נתון של נוירונים העיקרי.

4. זיהום של נוירונים Cultured

תרבויות עצב בהיפוקמפוס נגועים ב 14 ימים במבחנה פשוט על ידי הוספת סכום מוערך של הנגיף להדביק עד 50% מכלל הנוירונים מבוסס על נתונים cytometry הזרימה. Polybrene לא משמש. תרבויות נשמרות במשך 3 ימים לפני בדיקת ביטוי חלבון פלואורסצנטי. אם האות חלש מדי, אז התרבות הוא חזר בתרבית רקמה החממה להערכה מחדש לאחר מספר ימים.

5. תחזוקה כללית של החיים במעגל סגור מערכת תמיכה

1. כדי לשמור על לחות נאותה, לוודא כי ז'קט המים של חממה נבדקת מעת לעת מלא בעת הצורך. הקפד במקום נירוסטה או מגש אלומיניום בתוך האינקובטור המכיל נפח קטן של מים (25mm עמוק) ו algicide.
2. בעת הצורך, נקה את כניסת וצינורות לשקע של מעגל האווירה חממה על ידי ריקון המים שנאספו צינורות catchment. מדי פעם לרוקן את צינורות עם אתנול 70%.

6. יישום מכסה ממברנה כדי GBM ומיקום בשלב העליונה החממה

1. לפני המיקום של GBM בתוך השלב העליונה החממה, להחליף את מכסה הפלסטיק עם מכסה קרום מכוסה בברדס בתרבית רקמה. ברגע שזה נעשה, אתה יכול להזיז את GBM מכוסה המיקרוסקופ.
2. בזהירות במושב GBM עם מכסה, קרום מכוסה פתיחת הפסקה על בסיס השלב העליונה חממה. כדי להימנע הסואנים GBM, ודא כי הבסיס כבר נמצא מקום על הבמה מיקרוסקופ; מאז קליפים בסיס לשלב עם קצת קושי, עדיף למקם את GBM לאחר בבסיס נמצאת בעמדה.
3. יישר את המתחם חממה עם ההודעות פלדה על בסיס חממה ולהפחית את המתחם על הבסיס. הדק את thumbscrews עד חותם טוב מושגת בין המתחם לבין הבסיס.

7. תמונה רכישה

שים לב כי הרוב המכריע של פלטפורמות תוכנה זמין הדמיה יש פונקציונליות דומה על פני מגוון רחב של מיקרוסקופים וחומרה בנושא. מגוון רכישת התמונה פלטפורמות תוכנה לניתוח זמינים, כולל MetaMorph ותוכניות המיועדות גורם ספציפי של המיקרוסקופ, כגון לייקה Application Suite, של ניקון ש"ח-Elements ו AxioVision Carl Zeiss. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את רכישת התמונה ונהלים הניתוח ביצענו באמצעות Slidebook 5 (Intelligent הדמיה חידושים, דנוור, CO). עם זאת, הצעדים המרכיבים של כל פעולה המתוארת פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לשימוש במגוון רחב של תוכניות אחרות.

תיאור מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה, תצורות לסנן, מצלמת CCD, מקור קסנון אור, תוכנת הדמיה:

הדמיה דינמית של תחבורה המיטוכונדריה נוירונים בהיפוקמפוס, אנו משתמשים במיקרוסקופ DMI-6000B לייקה הקרינה דגם הפוכה 11-522-068 הבמה ממונע (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, גרמניה) מצויד Sensicam קוק EQ מצלמת CCD (קוק תאגיד, רומולוס, MI), למבדה גלגל 10-2 סאטר לסנן בקר (החברה סאטר Instrument, Novato, CA), וכן DG-4 סאטר 300W קסנון מקור האור. כדי להמחיש המיטוכונדריה שכותרתו עם החלבון MitoTurbo האדום פלורסנט, אנו משתמשים בשילוב של מסנן 555nm במקור DG-4 אור עירור ומסננים של 600nm (שיא; Sedat Quad beamsplitter דגם 86100bs מצויד קוביית לייקה DM לסנן סדרה, טכנולוגיה Chroma קורפ, Bellows Falls, VT) ו 617nm ב המיקרוסקופ לבין גלגל לסנן, בהתאמה, עבור פליטה.

עבור רכישת תמונה, ניתוח, אנו משתמשים במיקרוסקופ הדמיה דיגיטלית חבילת תוכנה Slidebook 5. זוהי חבילה מקיפה המאפשרת שליטה אוטומטית לחלוטין של המיקרוסקופ, הבמה, גלגל לסנן, המצלמה, מקור אור במהלך רכישת התמונה, כמו גם מגוון של עיבוד תמונה מודולים לניתוח.

להלן, אנו מספקים ספציפיים, צעד אחר צעד הוראות לרכישת זמן לשגות תמונות של המיטוכונדריה נע נוירונים שכותרתו fluorescently באמצעות Slidebook 5.

1. ודא מיקרוסקופ, בקר גלגל לסנן, מקור האור, מצלמת CCD להיות מופעל לפני פתיחת Slidebook 5.
2. הדמיה חיה של המיטוכונדריה, עבור מטרה הנפט טבילה 63X, להנמיך את הצריח אובייקטיבי מספיק כדי לספק גישה אובייקטיבית מתחת לבמה מיקרוסקופ (שלבהעליונה) החממה, ובזהירות להחיל שמן ישירות על פני השטח של המטרה. פתח את חלון להתמקד ידי לחיצה על סמל ה 'חלון' פוקוס 'בסרגל הכלים Slidebook. בחלון המוקד, להדליק את מנורת brightfield ידי הזזת המחוון שכותרתו "מנורה" כדי להתאים את עוצמת brightfield לרמה מתאימה. רוכשת להתמקד בתחום של תאים ולמצוא התא של עניין.
3. בכרטיסייה 'סקופ', בחר 'CY3 "פלואוריד. שימוש oculars, תחת תאורה פלורסנט למצוא את המטוס של מוקד במיטוכונדריה של תאים שעברו שכותרתו עם חלבון מיטו TurbRed. ברגע שיש לך להתמקד רכשה באמצעות oculars, לעבור למצלמה CCD מחדש לרכוש להתמקד במידת הצורך.
4. פתח את חלון ללכוד תמונה על ידי לחיצה על סמל "לכידת תמונה" בסרגל הכלים Slidebook. החל עם זמן חשיפה ראשונית של 100ms, למצוא זמן חשיפה אופטימלית באמצעות "מבחן 'ו' מצא את הטוב ביותר" כפתורים; לחילופין, אתה יכול להשתמש בלחצן 'פעם'. יש לזכור כי זמן החשיפה צריך לספק עוצמת מספיק להתפשט על פני השדה כל התמונה (למשל, 0-2500; מסומנים על ידי היסטוגרמה בחלק התחתון של החלון ללכוד תמונה) בתוך תקופת מינימום (למשל, 200-800ms).
5. לפני תחילת זמן לשגות רכישת התמונה, פתח את חלון "מתקדם" על ידי לחיצה על 'מתקדם' בכרטיסייה עדיין בתוך חלון לכידת תמונה. מצא את הכרטיסייה 'פוקוס', סמן את "Autofous" במהלך אפשרות time-lapse/multipoint "לוכדת, ולהתאים את ההגדרות פוקוס אוטומטי עבור רכישת זמן לשגות התמונה. באופן כללי, אנו משתמשים את הפרמטרים הבאים עבור פוקוס אוטומטי: עדכון להתמקד כל 2-3 מסגרות, לבחור את ערוץ פוקוס אוטומטי פלואוריד משמש הדמיה שכותרתו המיטוכונדריה, קרי CY3, טווח החיפוש סה"כ 2 אממ עבור הגדלה 63x.
6. בחלון "לכידת", תחת תיבת 'סוג לכוד ", לבדוק את האפשרות' Timelapse 'ובחר את המרווח הרצוי הדמיה ומשך הפגישה הדמיה תחת אפשרויות" לכידת Timelapse ". במחקרים שלנו של השפעות neuromodulators בתחבורה המיטוכונדריה, זמן לשגות הדמיה בוצע באחד המפגשים שעה שבה סך של 360 תמונות נרכשו ב 10 מרווחי השני בין תמונות.
7. התחל זמן לשגות רכישת התמונה על ידי לחיצה על כפתור "התחל" בצד, הימנית התחתונה של החלון "Capture".
8. לאחר הביקורת הראשונית, או, מושב הדמיה, לנהל נוירוטרנסמיטורים ריאגנטים אחרים דרך יציאות גבי הבמה העליון החממה להפעיל הפעלה דימות חדשה.

8. ניתוח תמונה

1. פתח את הקובץ נשמר התמונה לאחר הפגישה הדמיה האחרון.
2. המיטוכונדריה הפרט יכול להיות מתויג בסדרה זמן לשגות תמונה באופן אוטומטי או באופן ידני על ידי שימוש בפונקציות מיסוך הניתנים Slidebook 5.
3. תחת התפריט "מסכה", בחר "מגזר" משורת התפריטים. על ידי הזזת קו סף נמוך וגבוה של הכלי 'היסטוגרמה', מיסוך כל החלקיקים בכחול בתמונה כולה, מכסה את כל המיטוכונדריה הכיל בתהליך, אבל משאיר כמו חלקיקים בדידים ככל האפשר. החל את מסכת לסדרה את התמונה כולה.
4. יצירת מסכה השני (תחת תפריט "מסכה", בחר 'צור') שמכסה את כל התמונה למעט בתהליך של עניין שבה חלקיקים כבר מסומן על ידי מסכה הקודם. מטרה זו מושגת, ראשית, באמצעות הכלי "עיפרון" העבה לאתר את גבולות האזורים מחוץ לתהליך, ולאחר מכן, באמצעות הכלי "דלי הצבע" למלא את האזורים חסום. החל את מסכת לסדרה את התמונה כולה.
5. תחת "המסכה", "מסכת פעולות" בחר לבצע 'מינוס' המבצע, כלומר המסכה השנייה היא מפחיתים את המסכה אגרוף (התמונה כולה אלא בתהליך). מסכה שלישית יופק שבו רק תהליך של עניין מסומן. שים לב שזה המסכה החדשה תחול על סדרת התמונה כולה.
6. תחת "הערות", בחר 'אובייקט מזהים. "
7. בדוק את המשכיות מטלות המספרי של הפרט על ידי רעולי פנים המיטוכונדריה סקירה ידנית של סדרה התמונה (ב 5 Slidebook, ה 'לשחק', 'מסגרת קדימה' ו 'מסגרת הפוכה, "כפתורים מתחת לחלון תמונה יכול לשמש למטרה זו).
8. בחר את הכרטיסייה 'מסכת' בשורת התפריטים. תחת "המסכה", "מעקב אחר החלקיקים" לבחור ולהפעיל את "חלקיק היסוד מעקב" כדי ליצור "סטטיסטיקה נתיב," כולל הקואורדינטות של centroid עבור mitochondrion כל רעולי פנים.
9. מרחק נסע mitochondrion כל תמונה בין שתי מסגרות סמוכות מחושב הקואורדינטות של כל חלקיק בכל מסגרת.
10. במחקרים קודמים שלנו ההשפעה של neuromodulators על תנועת המיטוכונדריה, זיהינו שלוש האוכלוסיות ברורים של המיטוכונדריה:. "נייחים", "oscillatory 'ו' נע directionally" אם mitochondrion נוסע פחות מ 0.2 אממ (או 2 פיקסלים, בהגדלה 63X, 1 פיקסל = 0.10235 אממ) בתוך שעה אחת, זה מאופיין כ 'יציב'. אם mitochondrion עובר לפחות 0.2 אממ, אבל פחות מ 2.5 אממ, במחזור האנטרוגרד-מדרדר, הוא מוגדר כ 'oscillatory. " לבסוף, אם mitochondrion נוסע מרחק נטו של יותר מ 2.5 אממ בכיוון אחד, הם מסווגים כמו הזזת directionally. מתואר באיור 2 הוא ההיסטוגרמה מראה את התנועה של כל המיטוכונדריה שכותרתו בניסוי נציג, כמו גם תרשים עוגה המראה הפצה אחוז משלוש אוכלוסיות שונות של המיטוכונדריה.
11. מהירות ממוצעת של mitochondrion כל מחושבת לפי המרחק הכולל נסע במהלך הפגישה הדמיה נתון. המהירות הממוצעת של האוכלוסייה המיטוכונדריה מחושב על ידי הוספת מהירויות הפרט על ידי חלוקת המספר הכולל של מעקב המיטוכונדריה.
12. Kymographs ניתן להפיק באמצעות מודול הניתן Slidebook 5. באמצעות פונקציית 'מסכת', לצייר קו דק לאורך היקף שלם של תהליך מסוים (למשל האקסון); להיות בטוח לעבור כמו centroids המיטוכונדריה רבים ככל האפשר. עבור אל הכרטיסייה 'מסכת' בשורת התפריטים ובחר 'תפעול מתקדם, "ואחר כך" ניתוח עקומה חלקה. " השתמש הגדרת ברירת המחדל עבור ניתוח עקומה חלקה או התאמה אישית לפי הצורך. הפעל את מודול ניתוח עקומה חלקה. בתום הניתוח, רשם גלים של הפגישה הדמיה יוצג.
13. עבור שורת התפריטים 'תצוגה', בחר ולאחר מכן "ייצוא TIFF."
14. פתח את הציל. Tif הקובץ המכיל את רשם גלים ב-Photoshop או תוכנית דומה עיבוד תמונה להמיר את התמונה הפוכה בגווני אפור.

9. נציג תוצאות

על ידי מעקב וניתוח תנועה המיטוכונדריה נוירונים בהיפוקמפוס תרבותי, אנו הוכיחו קשר בין neuromodulation וסחר המיטוכונדריה. באופן ספציפי, מצאנו כי סרוטונין (5-HT) או אגוניסט לקולטן 5-HT1A, 8-OH-DPAT, מגרה את תנועת המיטוכונדריה (איור 2A-C) ^8, ואילו דופמין (DA) או אגוניסט קולטן D2, ברומוקריפטין, מעכב התנועה המיטוכונדריה (איור 2D-G) ^9.

באיור 1. עיצוב של מערכת סגורה הבמה העליון מעגל חממה הרכיבים הבאים של מערכת חממה מוצגים: חום עמידים המתחם delrin פלסטיק (א); פתח מלבני עבור חלון פלסטיק פוליקרבונט (ב); בסיס אלומיניום של החממה (ג); חורים. לקבל הודעות הפלדה של הבסיס (ד); חור בקוטר 35.1mm עם שפתיים דקות הפסקה במרכז חממה בסיס כדי להתאים מאכלים GBM 35mm (E), צינורות nalgene (הקשרים בין תרבות רקמות הבמה העליון חממות, מלכודות לחות) ( F, G, N); בתרבית רקמה חממה (H); משאבה לאקווריום (אני); אוויר חזק תיבת פלסטיק ABS (דיור עבור משאבת אקווריום) (J); 2000ml בקבוק Erlenmeyer (צעיף לדיכוי רטט צינור לפני הבמה העליון חממה) (K); המתחם פלסטיק מאוורר (L); מסגרת פלסטיק המכסה GBM 35mm (M); עמדת והברזים למיניהם פלסטיק (O). מיקומים של יציאות עבור הממשל של ריאגנטים מסומנים על ידי חצים צהובים (II).

איור 2. נציג התוצאות: הסדרת תחבורה המיטוכונדריה א. אקסון של נוירון עכברוש טיפוסי בהיפוקמפוס בתרבות. המיטוכונדריה שכותרתו עם חלבון lentivirus בקידוד ניאון מוצגים ירוק; אקסונים immunolabeled עם נוגדן phospho-neurofilament מוצגים באדום. היקף האקסון הוא הצביע על ידי ראשי חץ צהוב. תמונה מורכבת מארבע micrographs חופפים. ב דוגמה של סדרת זמן לשגות תמונת מראה שינויים בתנועה המיטוכונדריה לאחר מתן של 5-HT. תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה מאוחסנים רצפים כי הוסבו מאוחר יותר סרטי Quicktime. רצף של תמונות מראה נציג יחיד המיטוכונדריה בנקודות זמן שונות לפני (פאנל משמאל) והמנהל אחרי (פאנל מימין) של 8-OH-DPAT, אגוניסט לקולטן 5-HT1A. אנכי מלבן אדום מדגיש mitochondrion נייח (משמאל) mitochondrion oscillatory (מימין) על פני נקודות זמן שונות. Mitochondrion oscillatory המצוין (הפאנל השמאלי) הוא נע לכיוון הטרמינל האקסון לאחר הטיפול עם 8-OH-DPAT (פאנל הנכונה; אדום גובלת ראשי חץ לבן). הקו הצהוב אנכי (פאנל מימין) מציינת את נקודת ההתחלה של mitochondrion הנע. מרווחי זמן מוצגים בפינה הימנית התחתונה של כל מסגרת. הגדלה (63 ×) מצוין בפינה הימנית התחתונה של הפאנל הימני. ג, ד מגרשים מראה שינויים בתנועה המיטוכונדריה לאחר מתן של 5-HT. שינויים בתנועה לפני המיטוכונדריה (ג) ואחרי (ד ') הממשל של 5-HT מוצגים כפי חלקות מהירות (ציר X) לעומת עמדות הראשונית של המיטוכונדריה בודדים לאורך האקסון (ציר Y). מהירות ו שיעור נייח (אדום), oscillatory (כחול), ואת directionally נעים (ירוק) מ 'itochondria מיוצגים מגרשים תרשימי עוגה (ריבועי מעל חלקות), בהתאמה. קווים מנוקדים אדום מקרין מאזורים מודגשת של האקסון קריקטורה על ציר ה-Y של כל חלקה להצביע המיקום במידה המשוער של המגזר האקסון שהיה הדמיה. E, מגרשים פ מראה שינויים בתנועה המיטוכונדריה לאחר מתן של התובע. שינויים בתנועה לפני המיטוכונדריה (E) ואחרי (F) של הממשל התובע מוצגים כפי חלקות מהירות (ציר X) לעומת עמדות הראשונית של המיטוכונדריה בודדים לאורך האקסון (ציר Y). מהירות ו שיעור נייח (אדום), oscillatory (כחול), והעברה directionally (ירוק) המיטוכונדריה מיוצגים מגרשים תרשימי עוגה (ריבועי מעל חלקות), בהתאמה. קווים מנוקדים אדום מקרין מאזורים מודגשת של האקסון קריקטורה על ציר ה-Y של כל חלקה להצביע המיקום במידה המשוער של המגזר האקסון שהיה הדמיה. G, H. kymographs נציג מראה תנועה המיטוכונדריה תא עצב בתרבית לפני (G) ואחרי (H) הממשל אגוניסט של הקולטן D1R, ברומוקריפטין. נוירון היה צילמו במשך שעה אחת לפני שעה אחת הממשל (G) הבא (H) של ברומוקריפטין.

Discussion

העסקת lentivirus בתיווך הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ממוקד המיטוכונדריה בנוירונים בתרבית נגוע באינקובטור זול מעבדה בנוי הבמה העליון המאפשר הדמיה של תאים חיים על משכי זמן ממושך, הצלחנו לחקור את הקשר בין התנועה המיטוכונדריה אותות neuromodulatory , כגון סרוטונין (5-HT), דופמין (DA), ו אצטילכולין (ACH). המחקרים שלנו סייעו להבהיר מסלול איתות זה, בפעם הראשונה, קישורים סחר המיטוכונדריה לשינויים בפעילות של נוירונים, מווסתת על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון 5-HT ו התובע - כי הם בלב של תפקוד עצבי. אנו מוצאים כי השימוש חלבוני ניאון ממוקד מאפשר תצפית של המיטוכונדריה שכותרתו לחיות נוירונים בתרבית לאורך תקופות ממושכות שעשויים להיות רלוונטיים יותר פיזיולוגית מאשר משכי זמן קצר הרבה יותר, כי הם אפשריים באמצעות צבעים חיוניים. יתר על כן, את עוצמת האות חלבון פלואורסצנטי מאפשר לנו לשמור על חשיפה קצרה פעמים במהלך רכישת התמונה, צמצום האפשרות של photobleaching או phototoxicity. לבסוף, בשלב העליונה פשוט וזול אינקובטור השומר על טמפרטורה ולחות הסביבה, ו-CO ₂ רמות, תוך מזעור אידוי של התקשורת, מאפשרת לנו לעקוב אחר תנועת המיטוכונדריה נוירונים חיים במשך שעות ואפילו ימים. חוקרים המעוניינים לייצר שלב העליונה חממה לטווח ארוך תצפיות של המיטוכונדריה בנוירונים לחיות לא צריך לעקוב אחר פרטים מדויקים של העיצוב שלנו, ובלבד המאפיינים של החומרים המשמשים (למשל, קרום חדיר גז כדי למנוע אידוי של התקשורת ) וכן להחיל עקרונות (למשל, בקרת טמפרטורה ולחות, חציצה של תחזוקה pH, של osmolarity) הם בדרך כלל בקנה אחד עם מה שמתואר בפרוטוקול זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
כמות	תיאור (ואת מיקום באיור 1)
1	רקמות תרבות חממה (H)
1	מחממים עמידים פלסטיק המתחם (delrin או דומה) (א)
1	מסגרת פלסטיק המכסה GBM 35mm (עבור הדבקת קרום על צלחת פטרי) (M)
1-2	מטר ליניארי נקה PFTE (טפלון) קרום חומר
4	האגודל פליז ברגים
2	גוף קירור קטן נגדים 10kOhm (משמש גופי חימום בתוך המתחם חממה הבמה למעלה)
1	שנאי (אספקת הנוכחית 9V כדי נגדים)
1	חממה בקר טמפרטורה בדיקה (ויסות התרמוסטט של הכוח נגדים קירור באמצעות שנאי)
1	2000ml בקבוק Erlenmeyer (צעיף לדיכוי רטט צינור לפני שלב העליונה חממה) (K)
1	1 / 8 "גיליון sorbothane (חומר אטם הבסיס של שלב העליונה חממה)
1	אטום ABS (או מקביל) קופסת פלסטיק (דיור עבור משאבת אקווריום) (J)
1	משאבת אקווריום (אני)
1	מחשב קטן מאוורר הקירור
1	מארז פלסטיק מאוורר (L)
1	שנאי 9V עבור מאוורר המחשב
20-30ft	צינור Nalgene או סיליקון (הקשרים בין תרבות רקמות העליונה שלב חממות, מלכודות לחות) (F, G, N)
2	והברזים למיניהם פלסטיק (לפתוח ולסגור את זרימת האוויר לפני ואחרי שלב העליונה חממה) (O)
4	דוקרני פליז מחברים צינור (צינור לחיבורים מ / אל הבמה העליונה החממה המתחם אקווריום משאבה)
2	פליז מצמדים מהיר (עבור חיבורים צינור מ / אל הבמה העליונה חממה)
2	פליז מצמדים מהיר (עבור חיבורים צינור מ / אל הבמה העליונה חממה)

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Poly-D-ליזין	סיגמא אולדריץ	P7280-5mg
laminin	רוש ומדע יישומי	11243217001
35 מ"מ זכוכית התחתונה מנות	MatTek	P35GC-0-14-C
DMEM	החיים טכנולוגיות	10567
B27	החיים טכנולוגיות	17504-044
Glutamax	החיים טכנולוגיות	35050
ליפידים עתירי BSA	החיים טכנולוגיות	11020-021
L-Asparagine	סיגמא אולדריץ	P0380-100 גרם
L-פרולין	סיגמא אולדריץ	A8381-100 גרם
ויטמין B-12	סיגמא אולדריץ	V2876-100mg
5-HT	סיגמא אולדריץ	H9523-25mg
8-OH-DPAT	סיגמא אולדריץ	H8520-25mg
דופמין	סיגמא אולדריץ	H8502-5G
ברומוקריפטין	סיגמא אולדריץ	B2134-25mg
SKF38393	סיגמא אולדריץ	D047-100 מ"ג