Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

Özet

Biz uzun bir süre boyunca floresan mikroskobu ile yaşam nöronlar mitokondri görüntüleme sağlayan bir protokol açıklar. Uzun süre üzerinden Görüntüleme mitochondrially hedef floresan protein ve laboratuvarımızda tasarlanmış ve inşa edilmiştir ucuz bir sahne top inkübatör kullanımı lentivirüs aracılı ifade aracılığıyla gerçekleştirilir.

Özet

Mitokondriyal ulaşım ve nöronal fonksiyonu arasındaki ilişkiyi anlamak için, ^1-3 uzun süreler için canlı kültürlü nöronlar mitokondriyal davranışlarını gözlemlemek için kritik öneme sahiptir. Bu iskelet parçaları, organeller ve canlı hücrelerin diğer yapıların dinamik floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir sonra etiketli ve hangi hayati boyalar ve floresan proteinlerle kullanımı ile artık mümkün. Örneğin, embriyonik tavuk sempatik nöronlar, mitokondriyal hareket hayati boya rodamin 123 ⁴ ile karakterize edildi. Başka bir çalışmada, mitokondri mitochondrially hedef eYFP ⁵ transfeksiyon sıçan önbeyin nöronları görüntülendi. Ancak, bir takım konularda bile birincil dakika içinde nöronlar, saat veya gün görüntüleme sunar. Bunların başında: 1) uzun görüntüleme oturumları sırasında, sıcaklık, nem, ve pH gibi kültür koşullarında bakım, 2) elde edilen görüntü ve görüntü analizi sırasında sinyal yoğunluğu doğru ölçüm kalitesini sağlamak için güçlü, istikrarlı bir floresan sinyal; 3) görüntü alımı sırasında pozlama süreleri sınırlayıcı photobleaching en aza indirmek ve fototoksisite önlemek.

Burada, gözlem, görselleştirme ve yüksek temporal çözünürlük ve uygun yaşam destek koşulları altında kültürlü hipokampal nöronlarda mitokondriyal hareketin analizi izin veren bir protokol açıklar. Biz, iyi bir ısı düzenleme ve atmosferik gaz akışı sağlayan uygun bir sahne top inkübatör inşa edilmiş, ve aynı zamanda kararlı pH ve osmolarite temin medya buharlaşma derecesi sınırlar var. Bu inkübatör, sabit sıcaklık ve nem seviyeleri ve% 5-10 _{CO 2} / hava bir atmosfer sağlayan standart bir doku kültürü inkübatör, giriş ve çıkış hortumları ile bağlı . Bu tasarım, mutlaka uzun saatler hatta günler içinde hücre canlılığı sağlamak önemli ölçüde daha pahalı mikroskop inkübatörler bir düşük maliyetli bir alternatif sunmaktadır. Mitokondri görselleştirmek için, biz, mitokondri hedeflenen bir kırmızı floresan proteini kodlayan bir lentivirüs hücreleri enfekte. Bu istikrarlı bir xenon ışık kaynağı kullanımı ile birlikte, görüntü alımı sırasında pozlama süresini sınırlamak için bize izin verir ve tüm ama photobleaching ve fototoksisite engeller, kalıcı ve güçlü bir sinyal sağlar. İki enjeksiyon noktaları sahne top kuluçka üstüne amaçlanan nörotransmitter ve diğer reaktifler akut yönetim mitokondriyal hareketi modüle izin verir. Toplamı, bir organel hedefli kırmızı floresan proteini ve sahne üstü inkübatör, geleneksel bir ters floresan mikroskop, CCD kamera ve xenon ışık kaynağı kombinasyonu lentivirüs aracılı ifade bizimle mitokondriyal ulaşım zaman atlamalı görüntüler elde etmek için izin geleneksel hayati boyalar ve off-the-raf ömrü destek sistemleri dağıtımı çalışmalar mümkün olan daha uzun bir süre boyunca yaşayan nöronlar.

Protokol

1. Lab-inşa Sahne üst İnkübatör açıklaması

, 2) çevre atmosferin nem içeriği korumak nem kontrolü, yani; ve 3) kültür ortamında uygun pH bakım 1): ortam sıcaklığı kontrol ve düzenleme, uzun süreler için bir mikroskop sahnede canlı hücrelerin bakımı üç temel sorun sunuyor. Bu 'yaşam desteği' sorunları kültürlü nöronlar, sıcaklık ve pH değişiklikleri, özellikle duyarlı hücreleri uzun vadeli gözlem içeren deneyler için kritik öneme sahiptir. Aşağıda, biz, biz, uzun süre boyunca nöronların canlı görüntüleme için tasarlanmış ve inşa aşamasında top inkübatör basit bir laboratuar inşa edilen açıklar. Bu inkübatör, bir kapalı devre üzerinden% 10 CO ₂ /% 90 hava istikrarlı bir ısıtmalı (37 ° C), nemlendirilmiş bir atmosfer sağlayan bir standart doku kültürü inkübatör (Thermo Scientific, Asheville, NC), bağlı olduğu.

1. İnkübatör muhafaza: kuluçka vücut (Şekil 1 (I, II); A), siyah delrin plastik sağlam bir parça C & C bilgisayarlı freze makinesi imal edilmiştir . Bu önlemler 97.74mm (L) x 73.60mm (W) x 28.58mm (H) (96.74mm iç boyutları x 72.60mm x 27.58mm) kapalı bir hacmi yaklaşık 19.370 cm ^3. Kasanın her iki ucunda iki delik delinmiş ve dişli pirinç barbuslar / doku kültürü inkübatör için giriş ve çıkış hortumları karşılamak için monte edildi. 70.0mm x 43.0mm ölçülerinde dikdörtgen bir açılış, polikarbonat plastik pencere (Şekil B 1 (I, II)) yerleştirilmesi izin kasasının üstündeki öğütülmüş oldu . (C, Şekil 1 (I, II, III), sol üst köşede detaylı olarak gösterilen üst görünüm ve profil) inkübatör tabanı, 3 / 16 "alüminyum stok öğütülmüş, 159.77mm (L) x 109.86mm (W önlemler ) x 3.175mm (D) ve Leica motorlu iç konuları ile 3-plaka evre (Model 11-522-068 Leica GmbH, Leipzig, Almanya). Dört çelik mesajları eklemek girinti içine sığacak şekilde tasarlanmıştır bağlı gömme monte düz başlı vida ile thebase köşelerinde Bu ileti (Şekil 1 (II, III), D) kabul etmek her köşesinde delinmiştir inkübatör muhafaza için sağlam bağlantı noktaları sağlar. sorbothane conta (McMaster Carr, Inc, Elmhurst, IL) kesilmiş ve muhafaza / baz arayüzü bir sızdırmazlık sağlamak için tabanına monte edildi. parçacığı Dört pirinç kelebek mesaj tabanı (Şekil muhafaza güvenliğini sağlamak için kullanılan eşleştirme 1 (II, III); E; sol üst ayrıntılı); D) ince bir gömme dudak 35.1mm çapında delik 35mm GBMs (Şekil 1 (III) karşılamak için merkezi inkübatör tabanı kesildi ek bazlar diğer kültür çanak boyutları karşılamak için dizayn edilmiştir.
2. Isıtma elemanları: İki 10 Kohm ısı emici dirençleri (Digi-Key Corp, Thief River Falls, MN) inkübatör muhafazanın iç duvarlarına yapıştırılmış. Bu 9V DC, 500mA transformatör Yapay Yaşam 1000W teraryum sıcaklık kontrolörü (Carolina Pet Kaynağı, Irmo, SC) takılı kablolu vardır. Kablolu prob inkübatör muhafazanın polikarbonat pencere contası ile yerleştirilen bir iç ortam sıcaklığı algılar ve dirençleri akım belirler. Dirençler, doku kültürü inkübatör ile bağlantılı olarak, ortam sıcaklığı kontrol ilave bir önlem sağlar.
3. Kapalı devre bir atmosfer sistemi: bir,% 10 CO ₂ /% 90 hava sabit bir nemlendirilmiş ve ısıtmalı atmosfer sağlamak için, sahne üstü inkübatör, giriş ve çıkış hortumları (F, G Şekil 1 (I)) ile bağlı olduğu standart, su ceketli doku kültürü inkübatör (Şekil 1 (I), H); Forma Bilimsel Model 3154; Thermo Scientific, Inc, Asheville, NC). (Şekil 1 (I); F) sahne üstü inkübatör, giriş hortumunu bağlamadan önce, standart bir akvaryum pompası (I; Lifegard QuietOne Model 1200, Pentair Aquatics, El Monte, CA Şekil 1 (I)) içine çalışır bir kapalı devre korumak için (Model 1150, Pelikan Ürünleri, A.Ş., Torrance, CA; J Şekil 1 (I)) kapalı bir ABS plastik kutu içine olmuştur. Bu pompa, sahne üstü inkübatör, doku kültürü inkübatör, sürekli hava akımı destekler. Pompa sahne üst inkübatör titreşim iletimini en aza indirmek için bir susturucu gibi davranır; pompa aşamadan sonra, giriş hortumu 1500ml Erlenmeyer şişesi (K Şekil 1 (I)) çalışır. Bir çıkış hortumu (Şekil 1 (I); G) doku kültürü inkübatör (Şekil 1 (I), H) sahne üstü inkübatör önde gelen, kapalı bir bilgisayar fan (L Şekil 1 (I)) ile donatılmış. , pompa gibi, aynı zamanda sürekli hava akımı desteklemek için tasarlanmıştır.
4. 35mm GBM için PFTE membran kapak: görüntüleme için sahne üstü inkübatör önce nöronal kültürünü yerleştirmek için, 35mm GBM ile donatılmış özel bir banambrane kapağı (Şekil 1 (II, IV), M, sağ üst köşesinde gösterilen ayrıntı) gaz değişimi sağlamak ve aynı zamanda kültür ortamı buharlaşmasını en aza indirmek için. Sığar jant üzerinde gergin ve viton conta ile gerçekleştirildi; Bu kapak delrin plastik jant ve PFTE membran (Amerikan Durafilm A.Ş., Holliston MA Teflon) önceden kesilmiş sac oluşur delrin plastik jant kenarı boyunca gömme kanal.
5. Sahne top kuluçka polikarbonat pencere (Şekil 1 (II), merkez detay, B yakınlarındaki sarı oklar) içine enjeksiyon noktaları: İki delik delinmiştir. Paslanmaz çelik Hamilton şırınga verilen bir deney sırasında 5-HT, DA, çeşitli reseptör agonistleri ve antagonistleri, ve diğer reaktifler yönetmek için enjeksiyon noktaları sağlamak için uçları bu takıldı.

2. İlköğretim Hipokampal Kültürler hazırlanması

Tüm çalışma, ya bir BSL2 laminer akış kaputu ya da bir laminer akış tezgahı yapılır. İlköğretim hipokampal nöronlar standart prosedürlere ^6-7 göre E18 sıçan embriyolar izole edilir ve birincil kortikal astrositler klimalı olmuştur serum serbest ortamda yetiştirilen. Glial hücreler Tüm ^yöntemleri 7 göre hazırlanmıştır . Klimalı ortamda prolin ile desteklenmiş düşük glukoz DMEM, (1.76 ug / ml), asparajin (0.83 ug / ml), B12 vitamini (0.34 ug / ml), glikoz (20mm), lipid zengin BSA (0.5 mg / ml ) ve B27 ^8-10% 2. Nöronal gen transkripsiyonu ile müdahale olarak orta antibiyotik eklenir.

1. Poli-D-lisin (PBS içinde 0.05 mg / ml), 35mm cam alt kültür çanak merkezi cam lamel bölümü (GBM) Kapak ve 37 az iki saat ayakta terk ° C Poli-D-lizin çözüm aspire, BSL2 laminer akış kaputu 20 dakika kurumasını bekleyin. Laminin (PBS içinde 0.01 mg / ml) ile GBM poli-D-lizin kaplı lamel kısmı Kapak ve aşırı laminin çözümü çıkarmadan önce en az 40 dakika bekletin. 20 dakika boyunca bir kenara koyun.
2. E18 sıçan embriyoların beyinleri hippocampi teşrih ve bunları Nörobilim ⁶ Mevcut Protokoller açıklanan ayrıştırmaları.
3. GBM ortalama 110.000 hücre yoğunluğu için izin ayrışmış hücrelerin büyüme ortamına sulandırınız. Hazırlanıyor GBMs sayısına göre ana karışımı hücre gerekli konsantrasyonu hesaplayın.
4. Inkübatör set ata sıcaklığı 37 ° C ve% 10 CO ₂ /% 90 hava bir atmosfer karışımı bir numaralı seribaşı GBMs yerleştirin.
5. Üç beş gün sonra, ekle arabinozid C (0.14 ng / ml) glial proliferasyon bastırmak için, nöronlar büyüyen koşulları kültürlere bağlı.
6. Kültürlerin lentivirüs bulaşmasını iki hafta önce büyümek için izin verin. Bu süre zarfında, her üç günde bir, taze orta orta hacminin üçte biri her GBM değiştirin. Bu ozmotik şok ve hücre ölümüne yol açabilir, medya bu miktarı aşmayın.

3. Rekombinant lentivirüs Kodlama kırmızı floresan proteini hazırlanması

Rekombinant lentiviruses üretmek için tesislerine erişimi olmayan araştırmacılar için, ticari bir varlık örneğin Sistem Biyobilimler (Mountain View, CA) tarafından özel üretim bir seçenektir.

Mitochondrially hedefli bir kırmızı floresan protein geni (MitoTurboRFP Axxora LLC, San Diego, CA), sitomegalovirüs büyük acil erken gen ^promoter 11 arttırıcı transkripsiyonel kontrol altında kendi kendine inaktive rekombinant kedi aids virüsü eklenir . Rekombinant lentiviruses geçici transfecting 293T hücreleri tarafından üretilir.

1. PolyJet (SignaGen kullanarak ~ 75.000 hücre / cm ^2, ertesi gün, rekombinant viral vektör, FIV gag ve pol genleri, ve veziküler stomatit virüs G glikoprotein gen kodlayan plazmid ile birlikte transfect hücreleri, bir yoğunlukta Plaka 293T hücreleri Laboratuvarlar, Gaithersburg, MD). DNA (4.8 mg viral vektör, 4.8 mg gagpol plazmid, ve plazmid 2.4 mikrogram VSV G) toplam 12 ug 293T hücrelerinin her 10cm kültür yemek için kullanılır.
2. 24 saat sonra, artık DNA kaldırmak için fenol kırmızısı Hanks dengeli tuz solüsyonu ile kültür ortamı ve yıkama hücreleri aspire. 50μg/ml lipid zengin BSA ve Glutamax ile desteklenmiş serum bazal sinir orta 10ml ekle.
3. Ertesi gün, supernatant, filtre 0.2 mikron düşük protein bağlama filtre ile hasat ve Vivaspin 20 polyethersulfone ultrafiltrasyon ünitesi (Sartorius, Concord, ABD). Sırayla% 70 etanol, doku kültürü sınıf su ve fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkanarak Vivaspin birim önceden tedavi. Konsantre virüs içeren süpernatant ~ 30 dakika boyunca santrifüj 1500xg 50 kat. Sıvı N ₂ kısım virüs hazırlama ve mağaza.
4. Konsantre virüsün bir kısım ile sıçan B104 hücrelerini enfekte ve 72 saat sonra flow sitometri floresan protein ekspresyonu ölçüm virüs miktarını tahmin ediyoruz. Pozitif hücrelerin yüzdesi birincil nöronlar belirli bir sayıda floresan proteini ifade elde etmek için gerekli konsantre virüs virüs yani hacmi miktarı bir tahmin sağlar.

4. Kültür Nöronlar Enfeksiyon

Hipokampal nöron kültürlerinde in vitro flow sitometri verilere göre tüm nöronların% 50 kadar bulaştırmak için tahmin edilen virüs miktarını ekleyerek 14 gün bulaşmış. Yok polybrene kullanılır. Kültürler floresan protein ekspresyonu için kontrol etmeden önce 3 gün süreyle tutulur. Sinyal çok zayıfsa, o zaman birkaç gün sonra kültür doku kültürü kuvöz ve yeniden test iade edilir.

5. Kapalı Devre Yaşam Destek Sistemi Genel Bakım

1. Nemi korumak için, kuvöz su ceketi periyodik olarak kontrol edilmeli ve gerektiğinde dolu olduğundan emin olun. Su (25mm derinliğinde) ve yosunkıran küçük bir hacim içeren inkübatör paslanmaz çelik veya alüminyum tepsi içinde bir yer emin olun.
2. Gerektiğinde, havza tüpler toplanan su boşaltma inkübatör atmosfer devrenin giriş ve çıkış hortumları temizleyin. Hortumları periyodik olarak% 70 etanol ile yıkayın.

6. Membran Kapak, GBM ve Sahne top İnkübatör Yerleştirme uygulanması

1. Sahne top inkübatör içinde GBM yerleştirme öncesinde, doku kültürü kaputun içindeki zarla kaplı kapaklı plastik kapağı değiştirin. Bu yapıldıktan sonra, mikroskop kapalı GBM hareket edebilir.
2. Dikkatle koltuk gömme açılışında sahne top kuluçka baz zarla kaplı bir kapak ile GBM. GBM jostling önlemek için, baz mikroskop aşamasında yer zaten olduğundan emin olun; bazı zorluk aşamaya baz klipleri yılından bu yana, GBM, temel pozisyon sonra yere en iyisidir.
3. Inkübatör baz çelik inkübatör muhafaza hizalayın ve tabanı üzerine muhafaza düşük. Muhafazası ve baz istasyonu arasında iyi bir sızdırmazlık elde edilinceye kadar vidayı sıkın.

7. Image Acquisition

Mevcut görüntüleme yazılım platformları çoğunluğu mikroskoplar ve ilgili donanım geniş bir aralığında benzer işlevselliğe sahip olduğunu unutmayın. MetaMorph ve Leica Application Suite, Nikon'un NIS-Elements ve Carl Zeiss 'AxioVision gibi özel mikroskop yapar için tasarlanmış programlar da dahil olmak üzere, çeşitli görüntü toplama ve analiz yazılım platformları mevcuttur. Bu protokolde, görüntü elde etme ve Slidebook 5 (Akıllı Görüntüleme Yenilikler, Denver, CO) kullanılarak yapılan analiz prosedürleri açıklar. Ancak, bu protokolde tanımlanan her işlem oluşturan adımları kolayca diğer programların çeşitli kullanımına adapte olabilir.

Ters floresan mikroskop, filtre yapılandırmaları, CCD kamera, Xenon ışık kaynağı, ve görüntüleme yazılımı Açıklama:

Hipokampal nöronlarda mitokondriyal taşıma dinamik görüntüleme için, biz bir Cooke Sensicam EQ CCD kamera (Cooke ile donatılmış bir Leica DMI-6000B ters floresan mikroskop ve Model 11-522-068 motorlu sahne (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Almanya) Corporation, Romulus, MI), bir Sutter Lambda 10-2 filtre çarkı ve kontrolör (Sutter Instrument Company, Novato, CA) ve bir Sutter DG-4 300W Xenon ışık kaynağı. Sedat Dört ışın dağıtıcı Model 86100bs Leica DM serisi filtre küp, Krom Teknoloji monte görselleştirmek için mitokondri MitoTurbo Kırmızı floresan protein etiketli, uyarma ve 600Nm filtre (tepe DG-4 ışık kaynağı 555nm filtre kombinasyonu kullanan Corp, emisyon, sırasıyla, mikroskop ve filtre çarkı Falls, VT) ve 617nm Körük.

Görüntü toplama ve analiz için, biz, dijital mikroskopi görüntüleme yazılımı paketi Slidebook 5 kullanın. Bu mikroskop, sahne, filtre çarkı, kamera, ışık kaynağı ve görüntü alımı sırasında, görüntü işleme ve analiz modülleri yanı sıra çeşitli tam otomatik kontrol sağlar kapsamlı bir paket.

Aşağıda, floresan etiketli nöronlar Slidebook 5 kullanarak hareket mitokondri zaman atlamalı görüntüleri elde etmek için özel, adım adım talimatlar sağlar.

1. Mikroskop, filtre çarkı denetleyicisi, ışık kaynağı ve CCD kamera Slidebook 5 açmadan önce açık olduğunu emin olun.
2. Mitokondri canlı görüntüleme için, (ve sahne, 63X yağ daldırma amacı geçmek amacı, mikroskop sahne altında erişim sağlamak için yeterince objektif taret alt) Inkübatör-üst ve dikkatli bir şekilde objektif yüzeyine doğrudan yağı uygulayın. 'Odak Pencere' Slidebook araç çubuğundaki simgesini tıklatarak odak penceresi açın. Odak penceresinde, uygun bir seviyede aydınlık yoğunluğunu ayarlamak için 'lamba' etiketli bir kaydırıcı kaydırarak aydınlık lambayı açmak. Bir hücre alanında odaklanmak Edinme ve ilgi bir hücre bulmak.
3. 'Kapsam' sekmesi altında, 'CY3' flor seçin. Mito TurbRed protein etiketli hücrelerde mitokondri için floresan aydınlatma altında, Okülerin kullanarak odak düzlemine bulabilirsiniz. Okülerin odağı elde etmiş sonra, CCD kamera geçmek ve yeniden elde odak gerekirse.
4. 'Image Capture' Slidebook araç çubuğundaki simgesini tıklatarak görüntü yakalama penceresi açın. Alternatif olarak, 'Once' butonunu kullanabilirsiniz; 100ms bir başlangıç ​​maruz kalma süresi ile başlayan, 'Test ve düğmeler' En İyi bul 'kullanarak en uygun pozlama süresi bulmak. (Görüntü yakalama pencerenin altındaki histogram tarafından belirtilen örneğin, 0-2500) en az bir süre içinde (örneğin, 200-800ms), maruz kalma süresi tüm görüntü alanında yayılmış geniş bir yoğunluk sağlamak gerektiğini unutmayın.
5. Zaman atlamalı görüntü toplama başlamadan önce, görüntü yakalama penceresi içinde hala 'Gelişmiş' sekmesini tıklatarak 'Gelişmiş' penceresini açın. 'Odak' sekmesini bulun, time-lapse/multipoint yakalar 'seçeneğini sırasında' Autofous 'kontrol ve zaman atlamalı görüntü elde etmek için otomatik netleme ayarlarını. Genellikle, otomatik odaklama için aşağıdaki parametreleri kullanın: güncelleme her 2-3 kare odak toplam Arama aralığı 63x büyütme için 2 um; otofokus kanal görüntüleme için kullanılan flor mitokondri, yani CY3 etiketli olarak seçin.
6. 'Capture' penceresinde 'Yakalama Türü' kutusunun altında, 'Timelapse' seçeneğini işaretleyin ve 'Timelapse Yakalama seçenekleri altında istenen görüntüleme aralığı ve süresi görüntüleme oturumu seçin. Mitokondriyal taşıma nöromodülatör etkileri bizim çalışmalarda, zaman atlamalı görüntüleme, görüntüleri arasında 10 saniye aralıklarla toplam 360 görüntü elde edildi bir saatlik oturumlar yapıldı.
7. 'Capture' penceresinin sağ alt tarafında, 'Başlat' düğmesine tıklayarak zaman atlamalı görüntü elde etme başlayın.
8. Başlangıç ​​ya da kontrolü, görüntüleme oturumun ardından, nörotransmitterlerin ve diğer reaktifler, sahne top kuluçka üst bağlantı noktaları üzerinden yönetmek ve yeni bir görüntüleme oturumu başlatmak.

8. Görüntü Analizi

1. Son görüntüleme oturumundan sonra kaydedilen görüntü dosyasını açın.
2. Bireysel mitokondri Slidebook 5 sağlanan maskeleme fonksiyonları kullanılarak, otomatik ya da manuel bir zaman atlamalı görüntü dizi etiketli olabilir.
3. 'Maske' menüsü altında, menü çubuğunda 'Segment' seçin. Düşük ve yüksek eşik hattı 'histogram' aracını kaydırarak, mavi tüm parçacıkların tüm görüntü maskeleme, bu süreç içinde yer alan tüm mitokondri kapsayan, ama mümkün olduğunca ayrık parçacıklar bırakarak. Tüm görüntü serisi maske uygulayın.
4. Süreci parçacıklar önceki maske ile vurgulanır edildiği faiz hariç tüm görüntü kapsayan ikinci bir maske ('Maske' menüsü altında, 'Oluştur' seçeneğini) oluşturun. Bu, ilk olarak, başarılı bir 'kalem' kalın 'boya kovası' sınırlı bölgeleri doldurmak için aracını kullanarak, daha sonra sürecin dışında alanların sınırları iz ve aracını kullanarak. Tüm görüntü serisi bu maske uygulayın.
5. Altında 'Maske' select 'Operasyonlar Maske' ve 'eksi' işlemi, yani gerçekleştirmek, ikinci maske yumruk maskesi (sürecin dışında tüm görüntü) çıkartılır. Üçüncü bir maske olan ilgi sadece süreç vurgulanır oluşturulur. Tüm görüntü serisinin bu yeni maske uygulanan unutmayın.
6. Altında 'Açıklamalar' seçeneğini 'Nesne kimlikleri.'
7. Sürekliliği ve sayısal atamaları tek tek elle resim serisi gözden mitokondri maskeli doğrulayın (Slidebook 5, 'oyun', 'ileri çerçevesi' ve 'ters kare görüntü penceresinin altında' düğmeleri bu amaç için kullanılan olabilir).
8. Menü çubuğunda 'Maske' sekmesini seçin. 'Maske' altında, 'Partikül Takip' ve 'Temel Parçacık Takip her maskeli mitokondri için ağırlık merkezi koordinatları da dahil olmak üzere' Yol İstatistik, 'oluşturmak için.
9. Mesafe her iki komşu görüntü kareleri arasında mitokondri tarafından katedilen her çerçeve içinde her bir parçacık koordinatları hesaplanır.
10. Nöromodülatör mitokondriyal dolaşımı üzerindeki etkisi önceki çalışmalarda, üç farklı mitokondri popülasyonlarında belirledi. Yönde hareket eden 'kırtasiye,' salınım 've' ' Bir mitokondri (63X büyütme altında veya 2 piksel, 1 piksel = 0,10235 um) 0,2 'den az um yolculuk bir saat içinde olarak nitelendirilen' sabit. ' Mitokondri en az 0.2 um, ama en az 2 hamle.5 um, anterograd retrograd döngüsü olarak tanımlanır 'salınım' Yönde hareket olarak, mitokondri fazla 2.5 um tek bir yönde net bir mesafe yolculuk Sonunda, onu kategorize edilir. Şekil 2'de tasvir temsil eden bir deney, mitokondri üç farklı popülasyonlar yüzde dağılımını gösteren bir pasta grafik gibi tüm etiketli mitokondri hareketini gösteren bir histogram.
11. Her mitokondri ortalama hız, belirli bir görüntüleme oturumu sırasında katedilen toplam mesafeye göre hesaplanır. Mitokondriyal bir nüfusun ortalama hız, bireysel hızlar ekleme ve mitokondri paletli toplam sayısına bölünerek hesaplanır.
12. Kymographs Slidebook 5 sağlanan bir modül kullanarak oluşturulabilir. 'Maske' fonksiyonunu kullanarak, belirli bir süreç (örneğin akson) tüm ölçüde arasında ince bir çizgi çizin, mümkün olduğunca çok sayıda mitokondriyal sentroidler olarak geçmesine emin olun. 'Gelişmiş Operasyonları', menü çubuğu ve seçin 'Maske' sekmesine gidin ve sonra 'Smooth Eğrisi Analizi. " Pürüzsüz bir eğri analizi için varsayılan ayarı kullanın veya istediğiniz gibi özelleştirebilirsiniz. Pürüzsüz eğri analiz modülü çalıştırın. Analizin sonunda, görüntüleme oturumun bir kymograph görüntülenir.
13. 'İhracat TIFF sonra menü çubuğuna gidin ve' View 've
14. Photoshop kymograph bulunduğu kaydedildi. Tif dosyası veya buna benzer bir görüntü işleme programı açın ve dönüştürmek için görüntü ters gri tonlama.

9 - Temsilcisi Sonuçlar

Kültürlü hipokampal nöronlar mitokondriyal hareket izleme ve analiz, nöromodülasyon ve mitokondriyal kaçakçılığı arasındaki bağlantıyı göstermiştir. Özellikle, biz, bu serotonin (5-HT) veya 5-HT1A reseptör agonisti, 8-OH-DPAT bulundu, dopamin (DA) veya D2 reseptör agonisti olan bromokriptin, engeller ise mitokondriyal hareketi (Şekil ^{2A-C) 8,} uyarır mitokondriyal hareketi (Şekil 2D-G) ^9.

Şekil 1. Kapalı devre sahne üst inkübatör sistem tasarımı inkübatör sistemi aşağıdaki bileşenleri gösterilmiştir: Isıya dayanıklı delrin plastik muhafaza (A); polikarbonat plastik pencere dikdörtgen açılış (B); inkübatör (C) alüminyum taban; delik. tabanı (D) çelik mesajları kabul etmek; inkübatör tabanının merkezinde ince gömme dudak ile 35.1mm çapında delik 35mm GBM yemekleri (E) karşılamak için; Nalgene hortumlar (doku kültürü ve sahne üstü inkübatörler arasındaki bağlantıları, nem tuzakları) ( F, G, H), doku kültürü inkübatör (H), akvaryum pompası (I); hava geçirmez ABS plastik kutu (akvaryum pompası için konut) (J); 2000ml Erlenmeyer şişesi (hortumun titreşim önleme için susturucu sahne top önce inkübatör) (K); plastik muhafazası için soğutma fanı (L), 35mm GBM kapağı için plastik çerçeve (M), plastik stopcocks pozisyonu (O). Reaktiflerin yönetimi için limanların yerler (II) sarı oklarla gösterilir.

Şekil 2. Temsilcisi sonuçları: mitokondriyal taşıma A. düzenlenmesi Tipik bir kültür sıçan hipokampal nöron akson. Lentivirüs kodlanmış bir floresan protein ile etiketli Mitokondri yeşil gösterilir; kırmızı fosfor-nörofilaman antikor immunolabeled aksonlar gösterilmiştir. Akson kapsamı sarı ok uçları ile gösterilir. Resim, üst üste binmiş dört mikrograflar oluşmaktadır. 5-HT uygulamadan sonra mitokondriyal hareketinde değişiklik gösteren bir zaman atlamalı görüntü serisi B. örneği. Görüntüler ters bir floresan mikroskop üzerinden satın alınan ve daha sonra Quicktime filmleri dönüştürülür dizileri olarak saklanır. Önce farklı zaman noktalarında (sol panel) ve sonrası (sağ panel) 8-OH-DPAT, 5-HT1A reseptör agonisti yönetim mitokondri bireysel bir temsilcisi Görüntüler sırasını gösterir. Dikey kırmızı dikdörtgen bir sabit mitokondri (solda) ve (sağda), bir çok kez puan üzerinden salınım mitokondri vurgulamaktadır. Belirtilen (sol panel) salınım mitokondri 8-OH-DPAT (kırmızı kenarlı beyaz ok uçları, sağ panel) ile tedavi sonrası akson terminaline doğru hareket ediyor. Dikey sarı hat (sağ panel) hareketli mitokondri başlangıç ​​konumunu gösterir. Zaman aralıklarında, her bir karenin sağ alt köşesinde gösterilir. Büyütme (63 x), sağ panel sağ alt köşesinde gösterilir. C, 5-HT uygulamadan sonra mitokondriyal hareketinde değişiklik gösteren D. Arsalar. Önce mitokondriyal hareketinde değişiklikler (C) ve (D) 5-HT yönetim akson (Y ekseni) boyunca hız araziler (X ekseni) karşı bireysel mitokondri ilk pozisyonları olarak sunulmuştur. Hız ve oranı sabit (kırmızı), salınım (mavi), ve yönde hareket (yeşil) mitochondria araziler ve pasta grafikler (araziler yukarıdaki parçalar), temsil edilmektedir. Karikatür akson vurgulanan bölgelerden her komplo Y ekseni projelendirme Kırmızı noktalı çizgiler görüntülendi akson segmentinde yaklaşık konumu ve boyutu göstermektedir. E, F. Arsalar DA uygulamadan sonra mitokondriyal hareket değişiklikleri gösteren. Önce mitokondriyal hareketinde değişiklikler (E) ve (F) yönetim DA akson (Y ekseni) boyunca hız araziler (X ekseni) karşı bireysel mitokondri ilk pozisyonları olarak sunulmuştur. Hız ve oran sabit (kırmızı), salınım (mavi), ve yönde hareket (yeşil) mitokondri sırasıyla, araziler ve pasta grafikler (araziler yukarıdaki parçalar) temsil edilmektedir. Karikatür akson vurgulanan bölgelerden her komplo Y ekseni projelendirme Kırmızı noktalı çizgiler görüntülendi akson segmentinde yaklaşık konumu ve boyutu göstermektedir. G, H. önce bir kültür nöron mitokondriyal hareketi gösteren Temsilcisi kymographs, (G) ve sonra (H) D1R reseptör agonisti olan bromokriptin idaresi. Nöron bromokriptin (G) ve bir saat sonra (Y) idaresiyle ilgili olarak bir saat önce görüntülendi.

Tartışmalar

Lentivirüs enfekte kültürlü nöronlar mitokondri hedefleyen bir floresan protein aracılı ifade ve uzun süreler için canlı hücreleri görüntüleme sağlayan bir ucuz laboratuvar inşa aşamasında üst inkübatör istihdam, mitokondriyal hareket ve nöromodülatör sinyalleri arasındaki bağlantıyı araştırmak için mümkün olmuştur serotonin (5-HT), dopamin (DA), asetilkolin (Ach) gibi. Sinir fonksiyon kalp çalışmalar ilk kez, 5-HT ve DA nörotransmitterler nöronlar modülasyonlu aktivite değişiklikleri mitokondriyal kaçakçılığı bağlantılar, sinyal yolağı aydınlatmak için yardımcı oldu. Biz hedefli floresan proteinleri kültürlü nöronların fizyolojik ilgili hayati boyalar kullanarak mümkün olan çok kısa süreleri daha uzun süre boyunca yaşayan etiketli mitokondri gözlem izin verdiğini bulabilirsiniz. Ayrıca, floresan protein sinyal yoğunluğu photobleaching veya fototoksisite olasılığını en aza indirerek, görüntü alımı sırasında bize poz süreleri kısa tutmak için izin verir. Son olarak, basit ve ucuz bir sahne üst inkübatör medya buharlaşma en aza indirerek, ortam sıcaklığı, nem ve _CO 2 düzeyleri korur, bize saat ya da gün içinde bile yaşam nöronlar mitokondriyal hareketini takip sağlar . Canlı nöronlarda mitokondri uzun vadeli gözlemler için bir sahne üstü inkübatör imal etmek isteyen araştırmacılar koşuluyla, tasarım kesin ayrıntıları izleyin gerekmez medya buharlaşmasını önlemek için (örneğin, gaz geçirgen bir zar kullanılır malzemelerin özellikleri ) ve (örneğin, sıcaklık ve nem kontrolü, pH, bakım ozmolarite tamponlama) uygulanan ilkeler, bu protokol açıklanan ne ile tutarlı.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miktar	Açıklama (Şekil 1 Yer ve)
1	Doku kültürü inkübatör (H)
1	Isıya dayanıklı plastik muhafaza (delrin veya eşdeğeri) (A)
1	35mm GBM kapağı için plastik çerçeve (petri membran iliştirilmesi için) (M)
1-2	doğrusal ft Clear PFTE (Teflon) membran malzemesi
4	Pirinç parmak vida
2	Küçük 10kOhm soğutucu dirençleri (sahne top inkübatör muhafaza içinde ısıtma elemanları olarak kullanılır)
1	Trafo (9V mevcut arz dirençler için)
1	Terrarium sıcaklık kontrolörü ve prob (soğutucu dirençler güç trafosu üzerinden termostatik düzenleme)
1	2000ml Erlenmeyer şişesi (susturucu hortum önce sahne top inkübatör titreşim önleme için) (K)
1	1 / 8 "sorbothane sheet (sahne üst inkübatör baz conta malzemesi)
1	Hava geçirmez ABS (veya eşdeğeri) plastik kutu (akvaryum pompası için konut) (J)
1	Akvaryum pompası (I)
1	Küçük bilgisayar soğutma fanı
1	Soğutma fanı Plastik muhafaza (L)
1	9V bilgisayar trafo soğutma fanı
20-30ft	Nalgene veya silikon hortum (doku kültürü ve sahne üstü inkübatörler arasındaki bağlantıları, nem tuzakları) (F, G, N)
2	Plastik stopcocks (evre-üst inkübatör öncesi ve sonrası hava akışını açmak ve kapatmak için) (O)
4	Dikenli pirinç hortum bağlantısı (hortum bağlantıları için / sahne top kuvöz ve akvaryum pompası muhafaza)
2	Pirinç hızlı kuplörler (hortum bağlantıları için / sahne top inkübatör)
2	Pirinç hızlı kuplörler (hortum bağlantıları için / sahne top inkübatör)

Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
Poly-D-lizin	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
laminin	Roche Uygulamalı Bilimler	11243217001
35 mm cam alt yemekleri	Mattek	P35GC-0-14-C
DMEM	Yaşam Teknolojileri	10567
B27	Yaşam Teknolojileri	17504-044
Glutamax	Yaşam Teknolojileri	35050
Lipid-zengin BSA	Yaşam Teknolojileri	11020-021
L-Asparagin	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-prolin	Sigma-Aldrich	A8381-100G
Vitamin B-12	Sigma-Aldrich	V2876-100mg
5-HT	Sigma-Aldrich	H9523-25mg
8-OH-DPAT	Sigma-Aldrich	H8520-25mg
Dopamin	Sigma-Aldrich	H8502-5G
Bromokriptin	Sigma-Aldrich	B2134-25mg
SKF38393	Sigma-Aldrich	D047-100mg