El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Resumen

Se presenta un protocolo que permite ver y para evaluar cuantitativamente la morfología del árbol dendrítico de las células de Purkinje individuales cultivadas en cultivos de cortes organotípicos cerebelosos. Este protocolo tiene como objetivo promover estudios sobre los mecanismos de desarrollo de Purkinje células dendríticas.

Resumen

Células de Purkinje son un sistema de modelo atractivo para el estudio de desarrollo dendrítico, porque tienen un árbol dendrítico impresionante que es estrictamente orientada en el plano sagital y se desarrolla principalmente en el periodo postnatal en roedores pequeños ^3. Además, los anticuerpos se encuentran disponibles varios que selectivamente y de forma intensiva marcar células de Purkinje, incluyendo todos los procesos, con anti-Calbindin D28K siendo el más ampliamente utilizado. Para la visualización de las dendritas en las células vivas, los ratones que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje ¹¹ están disponibles a través de los laboratorios Jackson. Organotípicos culturas cerebelosos rebanada células permiten una fácil manipulación experimental de desarrollo Purkinje células dendríticas porque la mayor parte de la expansión dendríticas del árbol dendrítico de células de Purkinje que de hecho ocurre durante el período de cultivo ^4. Presentamos aquí un protocolo corto, fiable y fácil para la visualización y el análisis de la morfología dendrítica de las células de Purkinje crecido en organotypic cultivos de cortes cerebelosos. Para muchos fines, una evaluación cuantitativa del árbol dendrítico de células de Purkinje es deseable. Nos centramos aquí en dos parámetros, tamaño del árbol dendrítico y los números de punto de ramificación, que puede ser rápidamente y fácilmente determinadas a partir de anti-calbindina cultivos teñidos rebanada cerebelosos. Estos dos parámetros obtener una medida fiable y sensible de los cambios del árbol de células dendríticas Purkinje. Usando el ejemplo de los tratamientos con la proteína quinasa C PMA (PKC) y el activador del receptor de glutamato metabotrópico 1 (mGluR1) se demuestra cómo las diferencias en el desarrollo dendrítico se visualizan y evaluó cuantitativamente. La combinación de la presencia de un árbol dendrítico extensa, los métodos selectivos y de inmunotinción intensa, cultivos organotípicos rebanada que cubren el período de crecimiento dendrítico y un modelo de ratón con expresión de células de Purkinje EGFP específico hacer las células de Purkinje un sistema modelo de gran alcance para revelar los mecanismos de la dendríticas desarrollo.

Protocolo

1. Configuración de organotípicos cultivos de cortes cerebelosos

Cultivos cerebelares rebanada se preparan a partir día postnatal 8 P (8) crías de ratón utilizando el método de incubación estática ^10. En nuestro laboratorio utilizamos B6CF1 ratones. En algunos experimentos los ratones transgénicos también se utilizaron que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje. La preparación de cultivos de corte es de unos 30 minutos por cada ratón cachorro, es decir, 3 horas para una camada de seis crías de ratón. Todos los pasos se llevan a cabo en condiciones estériles en un banco de trabajo de flujo laminar con instrumentos quirúrgicos esterilizados.

1. El cerebelo de crías de ratón P8 se disecciona el cerebro en un medio de preparación enfriado con hielo (MEM (Gibco N º de catálogo 11012) con glutamax 1:100, pH 7,3) utilizando un estereomicroscopio.
2. El cerebelo se corta en rodajas de 350 m de espesor en la orientación sagital utilizando un cortador de tejidos McIlwain.
3. Las rodajas se colocan en Millipore insertos de cultivo de células (approx.6 rebanadas por inserción, Millipore PICM03050) y se incuban a 6-y las placas con 0,75 ml por pocillo de medio de incubación (48,35 ml de MEM, 25 ml de Medio Eagle, 25 ml de suero de caballo, 1 ml glutamax I, 0,65 ml de una glucosa estéril al 10% solución, pH 7,3) en un ambiente humidificado con 5% de CO ₂ a 37 ° C. Todos los reactivos de cultivo de tejidos fueron de Gibco, Invitrogen.
4. Los tratamientos farmacológicos normalmente se inician a los 3 días in vitro (DIV3) mediante la adición de la droga en la concentración deseada para el medio de cultivo. Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y (RS) -3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) eran de Tocris, UK. Dado que muchos fármacos requieren el uso de DMSO o etanol para preparar una solución madre (por ejemplo, PMA) se debe tener cuidado de que la cantidad total de disolvente añadido al medio de cultivo no debe exceder del 1% (7,5 ml por pocillo). Los fármacos se renuevan junto con el cambio del medio de cultivo cada 2 ^ª o 3 ^º día.

2. La fijación y Immunoscontengan organotípicos de cultivos de cortes cerebelosos

Una ventaja importante de que el cerebelo es que los anticuerpos que específicamente están disponibles y brillantemente teñir las neuronas principales del cerebelo, es decir, células de Purkinje y células granulares. La morfología dendrítica de las células de Purkinje puede ser revelado por inmunotinción con anti-calbindin D28K.

1. Para la fijación de los cultivos, el medio de cultivo se elimina y 3 ml de paraformaldehído al 4% frío en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) se añadió cuidadosamente por pocillo que contenía el inserto Millicell con los cerebelar rebanadas fijadas a la membrana. Los cultivos se fijaron durante la noche, a continuación, el fijador se retira y se lavan los cultivos con tampón de fosfato.
2. Para la inmunotinción de los anticuerpos se utilizan los siguientes: conejo anti-calbindin D-28K (Swant, Bellinzona, Suiza) a 1:1000 para visualizar selectivamente células de Purkinje y monoclonal anti-NeuN (Chemicon, Millipore) a 1:500 para visualizar selectivamente Granule células ^12. De conejo anti-GFP fue de Abcam, UK. Secundaria de anticuerpos fluorescentes Alexa eran de Molecular Probes, Invitrogen.
3. Los cultivos se permeabilizaron y se bloquearon mediante la adición de 3% de suero normal de cabra + 0,3% TritonX100 en tampón fosfato 0,1 M (solución de bloqueo). Anti-calbindin D28K y anti-NeuN se diluyen en solución de bloqueo y los cultivos se incuban con la solución de bloqueo que contiene los anticuerpos durante la noche a 4 ° C bajo ligera agitación. Todas las diluciones se indican como% (v / v), Triton X100 se toma de una solución madre de 10% con el fin de facilitar el pipeteado.
4. Los cultivos se enjuagan 3 veces con tampón de fosfato 0,1 M y se incuban con anticuerpos adecuados segundos, por ejemplo de cabra anti-conejo Alexa 568 y de cabra anti-ratón Alexa 488 diluido 1:500 en tampón fosfato 0,1 M + 0,1% de TritonX100 durante 2 horas a temperatura ambiente. Los cultivos se enjuagan 3 veces con tampón de fosfato 0,1 M.
5. Las rodajas teñidas son eliminados de la culturabien con un pincel y se montan en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus y cubreobjetos con un medio de montaje adecuado, por ejemplo Mowiol. Las culturas pueden ahora ser visto en un microscopio de epifluorescencia regular con el equipo o con un microscopio confocal.

3. Visualización de las células de Purkinje individuales en cultivos de corte organotípicos

1. Después de la inmunotinción con Calbindin D28k el citoplasma completa de las células de Purkinje se brillantemente teñidas incluyendo las dendritas y el axón. Debido a la alineación denso de células de Purkinje en la capa de células de Purkinje, los cenadores dendríticas de la mayoría de las células de Purkinje se superponen por lo que es difícil de estudiar el árbol completo de una célula individual. Sin embargo, debido a la muerte celular de algunas células de Purkinje durante el proceso de preparación, en muchas culturas algunas áreas están presentes con una densidad reducida de las células de Purkinje. En estas zonas, es posible encontrar células de Purkinje con un cenador dendrítico completo que no se solapa con otra cells. En estas células, el árbol dendrítico pueden ser vistos y analizados en una calidad comparable a una tinción de Golgi. Debido a que en el cerebelo las células de Purkinje son el único tipo de células que expresan Calbindin D28K las células también se identifican como células de Purkinje.
2. Un método alternativo es el uso de cultivos derivados de B6; FVB-Tg (PCP2-EGFP) 146.244Yuza / J ratones (aquí llamado PCP2-EGFP ratones, disponible de Jackson Laboratories) que expresan EGFP bajo la célula de Purkinje específico L7 promotor ^11. En cultivos de corte tales que viven las células de Purkinje se puede visualizar mediante la expresión de EGFP. También es posible seguir la morfología dendrítica de una sola celda con el tiempo. Alternativamente, después de la fijación, las células que expresan EGFP-Purkinje puede inmunotiñeron con un anticuerpo anti-GFP. Ambos métodos son adecuados para la tinción de dendritas, cuerpos celulares y axones de las células de Purkinje en cultivos organotípicos. Debido a que el promotor L7 en los ratones PCP2-EGFP no se expresa en todas las células de Purkinje y hay variations en la frecuencia de expresión de células de Purkinje entre ratones (Kapfhammer, datos no mostrados) rebanada cultivos derivados de estos ratones que sea más fácil de visualizar y medir las células de Purkinje que tienen árboles dendríticos que se solapan con otros árboles de Purkinje de células dendríticas. Tales árboles dendríticos se pueden ver individualmente cuando las células de Purkinje vecinos con la superposición de los árboles dendríticos no expresan GFP (Figura 1A, B).

4. Medición del tamaño de células de Purkinje árbol dendríticas y puntos de ramificación

1. Tamaño del árbol dendrítico. Con el marcaje fluorescente de las células de Purkinje del tamaño del árbol dendrítico de una célula dada puede medirse fácilmente si el árbol no se solapa con otras células. Dado que las etiquetas de inmunotinción calbindina todas las células de Purkinje, puede ser difícil identificar las células que no se solapan con árboles dendríticos. En este caso el uso de la PCP2-EGFP se recomienda para simplificar la identificación de la célula de Purkinje suficientes que no se solapan con los árboles dendríticos. Una vez que una célula de Purkinje con un árbol que no se superponen dendríticas se identifica, se vieron con la lente de 20x y la imagen se registra con una cámara digital. Esta imagen puede ser analizada con un programa de análisis de imagen. Utilizamos Image Pro Plus, que permite esbozar el árbol dendrítico de la célula con un solo clic del ratón con la herramienta varita mágica en el modo de medición (Figura 2A). Entonces, el programa calcula el área cubierta por el árbol dendrítico y la exporta a MS Excel. El análisis estadístico de los datos se realiza con software GraphPad Prism (ver más abajo).
2. Número de puntos de ramificación. Debido a la morfología altamente ramificado y fina de los puntos de células de Purkinje dendríticas rama de árbol tienen que ser contados manualmente. El archivo de imagen de 20x de las células de Purkinje se amplía de tal manera que cubre la mayor parte de la pantalla usando Adobe Photoshop. Entonces cada punto de ramificación se cuenta y se marca con un punto brillante (Figura 2B).

5. Los resultados representativos

Seguimiento del desarrollo del árbol dendrítico de células de Purkinje durante el período de cultivo
Los cultivos organotípicos rebanada derivados de PCP2-EGFP ratones que expresan EGFP específicamente en las células de Purkinje permiten estudiar la morfología de las células individuales durante varios días en cultivo. De esta manera el crecimiento y el desarrollo del árbol dendrítico durante el período de cultivo bien puede ser documentada. Living identificadas las células de Purkinje se fotografiaron todos los días ^ª 2 ^ª o 3 durante el período de cultivo, con el objetivo de 10x. Este objetivo de baja potencia se eligió para evitar y minimizar el daño fototóxico a las células debido a la iluminación con luz fluorescente. Figura 3 muestra dos ejemplos de células de Purkinje fotografiadas en cultivos vivos. La célula primera fue seguido de 2 días in vitro hasta 7 días in vitro (Figura 3, AC). Es evidente que la dendritic árbol de esta célula durante este período de tiempo crece varias nuevas sucursales y se expande en tamaño. En el segundo ejemplo, una célula de Purkinje fue seguido de 4 a 11 días in vitro (Figura 3, DF). El árbol dendrítico pequeño presente en DIV4 expande considerablemente durante este período de tiempo. Ambos ejemplos muestran que la mayor parte del árbol dendrítico de las células de Purkinje presentes al final del periodo de cultivo, efectivamente, se desarrollan en el cultivo.

Desarrollo del árbol de células dendríticas Purkinje es inhibida por PKC o estimulación mGluR1
Cultivos de cortes organotípicos cerebelosas se cultivaron durante 11 días. Comenzando en el día 2 ^nd in vitro, algunos de los cultivos se trataron con PMA (50 nM), un éster de forbol estimulación de la PKC o DHPG (10 mM), un agonista de mGluR1, hasta que los cultivos se fijaron. Ambos compuestos se ha demostrado previamente para inhibir y limitar el crecimiento de células de Purkinje dendríticas ^{7, 8, 9, 5.}En el control no tratado rebanadas de células de Purkinje desarrollado un típico árbol dendrítico grande y altamente ramificado que se visualizó ya sea por anti-Calbindin inmunotinción (Figura 4A) o en cultivos con EGFP-expresión de células de Purkinje, por inmunotinción con anti-GFP (Figura 4D). En los cultivos tratados con PMA la morfología del árbol dendrítico fue profundamente alterada. Las dendritas aparecía engrosado y tenían ramas cortas sólo unos pocos secundarios. Muchas células de Purkinje, a diferencia de los cultivos de control, ya no eran unipolar, con una dendrita primaria que emana del cuerpo de la célula, pero desarrollado dos o incluso más dendritas primarias (Figura 4B, E). El territorio cubierto por el árbol dendrítico se redujo notablemente (ver más abajo). Una situación similar se presentó en DHPG los cultivos tratados. El árbol dendrítico de las células de Purkinje se redujo mucho en tamaño y que la ramificación se redujo notablemente (Figura 4C, F). Sin embargo, también hubo alguna qualitative diferencias en comparación con los cultivos tratados con PMA. No hubo engrosamiento de las ramas dendríticas, y las dendritas primarias realizadas muchas dendritas secundarias muy cortas (Figura 4C, F) lo que sugiere que los eventos de señalización pasa en PMA y DHPG tratados con células de Purkinje pueden ser similares, pero no idénticos.

La evaluación cuantitativa de tamaño de células de Purkinje árbol dendríticas y puntos de ramificación para la evaluación cuantitativa, el tamaño del árbol dendrítico de células de Purkinje y el número de puntos de ramificación por célula Purkinje se mide como se ha descrito anteriormente. Los resultados de al menos tres experimentos independientes se agruparon, y un mínimo de 20 células necesitan ser analizados. La media de la zona cubierta por los árboles dendríticos para los experimentos de control se determina y se establece como 100%, y los valores de los otros experimentos se expresan como valores de porcentaje en consecuencia. El análisis estadístico de los datos se realiza con software GraphPad Prism. Debido a que nosuponer que todos los valores determinados son parte de una distribución de Gauss, es usar pruebas estadísticas que no suponen una distribución de los valores medidos. Para comparar varias condiciones y las pruebas de significación estadística, utilizamos Kruskal-Wallis seguida de un procedimiento adecuado para las pruebas post hoc para la clasificación basada en las estadísticas, como, por ejemplo, aplicado en post test de Dunn en GraphPad Prism. Los resultados se presentan típicamente en forma de gráficos de barras. Un ejemplo de tal una evaluación estadística se da en la Figura 5. Tanto el análisis del tamaño del árbol dendrítico (Figura 5A) y el número de puntos de ramificación por célula de Purkinje (Figura 5B) muestran claras diferencias entre la condición de control y tratamiento DHPG o PMA. Ambos parámetros fueron diferentes con una significación estadística de p <0,001 según la prueba de Kruskal-Wallis.

Figure 1. EGFP marcado con células de Purkinje. En PCP2-EGFP ratones no todas las células de Purkinje expresa EGFP. Por lo tanto, los árboles dendríticos de algunas células de Purkinje se pueden ver individualmente cuando se expresa EGFP (EGFP canal en A) y las células de Purkinje vecinos con la superposición de árboles dendríticos no (negativa en el canal de EGFP se muestra en A, positivo en la tinción anti-Calbindin mostrado en el canal rojo en B). Barra de escala = 50 micras.

Figura 2. Medición de parámetros dendríticas de las células de Purkinje. (A). El tamaño del árbol dendrítico se puede medir fácilmente trazando el contorno de la célula de Purkinje con un solo clic del ratón en el análisis Pro Imagen de software más con la herramienta varita mágica. La herramienta Varita mágica se utiliza de modo que el árbol dendrítico completo, incluyendo el soma celular y todas las ramas dendríticas son completamente rodeada por la línea. (B). El número de puntos de ramificación es counted manualmente en imágenes de las células de Purkinje. Cada punto de ramificación está marcado con un punto amarillo. Barra de escala = 50 micras.

Figura 3. Seguimiento del desarrollo del árbol de células dendríticas Purkinje. Identificado células de Purkinje se fotografiaron varias veces para controlar el crecimiento del árbol dendrítico. (AC): árbol dendrítico de una célula de Purkinje en crecimiento y desarrollo de días in vitro (DIV) 2 hasta DIV7. Hay un continuo crecimiento y la ramificación de las dendritas durante este periodo de cultivo. (DF): árbol dendrítico de la célula de Purkinje crece y se desarrolla a partir de DIV4 hasta DIV11. El árbol dendrítico se expande considerablemente durante este período de cultivo. Barra de escala = 50 micras.

Figura 4. Desarrollo del árbol de células dendríticas Purkinje es inhibida por PKC o stimulati mGluR1en (A), (D):. células de control sin tratar con un árbol dendrítico bien desarrollado. (B), (E): Tras 9 días de tratamiento con PMA dendritas aparecer engrosada y el árbol dendrítico está fuertemente reducido en tamaño. Las células a menudo pierden su polarización y convertirse bipolar (E). (C), (F): Después de 9 días de tratamiento DHPG el árbol dendrítico es muy reducido en tamaño. Al contrario que en el tratamiento con PMA, muchas ramas laterales muy finas y cortas están presentes en las dendritas primarias y secundarias. Las células a menudo pierden su polarización y convertirse bipolar (F). Las células de Purkinje se visualizaron por anti-Calbindin inmunotinción en (A - C) y por EGFP-expresión en cultivos derivados de PCP2-EGFP ratones en (D - F). Barra de escala = 50 micras.

Figura 5. La evaluación cuantitativa del tamaño de células de Purkinje árbol dendrítico y la ramificación. Las mediciones cuantitativas muestran que tanto el tamaño del árbol dendrítico (gráfico de barras superior) y el Number de puntos de ramificación (inferior gráfico de barras) se reducen considerablemente después del tratamiento PMA o DHPG. Las diferencias entre los árboles dendríticos de control y los árboles dendríticos de las células de Purkinje de cultivos tratados fueron significativas con p <0,001.

Discusión

Los métodos aquí presentados permiten estudiar el desarrollo de células de Purkinje dendríticas en cultivos de cortes organotípicos cerebelares y para evaluar cuantitativamente la expansión Purkinje de células dendríticas mediante la medición de tamaño de árbol dendrítico y el número de puntos de ramificación dendríticas. Por supuesto, un análisis cuantitativo más amplio y sofisticado de las dendritas de células de Purkinje es posible, por ejemplo, determinando la longitud dendrítica total, realizando...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Insertos de cultivo de tejidos	Millipore	PICM 03050 PICM ORG50	Los PICMORG50 insertos tienen un borde bajo y permitir la visualización de las culturas vivas en un microscopio
MEM	Gibco, Invitrogen	11012044
Glutamax 1	Gibco, Invitrogen	35050038
Basal de Eagle Meidum	Gibco, Invitrogen	41010026
El suero de caballo	Gibco, Invitrogen	26050070
Forbol 12-myristaTE-13-acetato (PMA)	Tocris	1201
(RS) -3,5-dihidroxi-fenilglicina (DHPG)	Tocris	0342
Rabbit anti-calbindin D-28K	Swant	CB38
Lucha contra NeuN, clon A60	Chemicon, Millipore	MAB377
De conejo anti-GFP	Abcam	Ab290