JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bakterilerin hızlı tespiti için bir etiket içermeyen optik biyosensör sokulur. Biosensor direkt olarak yüzey üzerine, hedef bakteri hücreleri yakalamak için tasarlanmış bir nano yapılı gözenekli Si, dayanmaktadır. Bu yakalama problar olarak, gözenekli transdüktörün üzerine immobilize monoklonal antikorları kullanır. Çalışmalarımız (örneğin, hücre liziz gibi) önceden bir numune işleme ile birkaç dakika içinde, düşük bakteriyel konsantrasyonlarının saptanması için, bu biyosensör uygulanabilirliğini göstermektedir.

Özet

Nano yapılı bir gözenekli Si göre bir etiket içermeyen optik biyosensör model bir mikroorganizma olarak, Escherichia coli K12 bakterilerin hızlı yakalanması ve teşhisi için tasarlanmıştır. Incelenen numunenin (hücre lizizi ile) herhangi bir ön-muamele gerekli iken biosensor, kendi yüzeyi üzerine hedef bakteri hücrelerinin doğrudan bağlanma dayanır. Bir gözenekli Si ince film biyosensör optik dönüştürücü eleman olarak kullanılır. Beyaz ışık aydınlatma altında, gözenekli katman kendi yansıtma spektrumu iyi bir çözüme Fabry-Perot saçak desenleri görüntüler. Hızlı Fourier tek bir zirve yansıtma veri sonuçlarına (FFT) dönüşümü uygulamak. FFT tepe yoğunluğuna değişiklikler izlenir. Bu nedenle, hedef bakteri, bir antikor-antijen etkileşimleri yoluyla bir biyo-algılayıcı yüzeyi üzerine yakalama bakteri ek bir "gerçek zamanlı" gözlem için izin FFT piklerin yoğunluğu ölçülebilir bir değişiklik, neden olur. nt "> elektrokimyasal anotlama işlemi ile imal edilmiş gözenekli Si film, hedef bakterilere özel monoklonal antikorlar ile konjuge edilir. Hareketsizleştirme, immunoactivity ve antikor özgüllüğü floresan etiketleme deneyleri ile teyit edilir. biyosensör için ortaya çıktığında Hedef bakteri, hücreler direkt olarak antikor ile modifiye edilmiş gözenekli Si yüzeyi üzerine yakalanır. Bunlar, belli olaylar yakalama biyosensör ince film optik girişim spektrumu yoğunluk değişikliklere neden olmaktadır. Bunların biyosensörler (saptama, nispeten düşük bakteri konsantrasyonu algılayabilir olduğunu göstermektedir Bir saatten az 10 4 hücre / ml) sınırı.

Giriş

Patojenik bakterilerin erken ve doğru tespit gıda ve su güvenliği, çevresel izleme ve nokta-bakım teşhis 1 için son derece önemlidir. Geleneksel mikrobiyoloji teknikleri zaman zahmetli, alıcı, ve "gerçek-zamanlı" veya laboratuvar ortamı dışında mikroorganizmaları tespit yeteneğinden yoksun olarak, biyosensörler bu zorlukların 2-5 karşılamak için gelişmektedir.

Son yıllarda, gözenekli Si (PSI) sensörler ve biyosensör 6-20 tasarımı için umut verici bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Geçtiğimiz on yıl içinde PSi-tabanlı optik sensörler ve biyohissedicilerin ilgili çok sayıda çalışmalar 21,22 yayınlandı. Nano yapılı PSi tabaka tipik olarak, tek-kristal Si gofret anodik elektro-kimyasal bir dağlama aracılığı ile imal edilmektedir. Elde edilen nano PSi gibi büyük yüzeyi ve serbest hacmi olarak çok avantajlı özellikler sergiler, kontrol edilebilir ve ayarlanabilir boyutları Opti gözenekcal özellikleri 10,16. Böyle fotolüminesans 8,11 ve beyaz ışık yansıtma tabanlı interferometri 7,19 olarak PSi tabakasının optik özellikleri, çevresel şartlardan etkilenmektedir. Fotolüminesans spektrumda bir modülasyon veya yansıtma spektrumu dalga boyu 10 bir kayma olarak gözlenen film, ortalama kırılma endeksi bir değişiklik ile, gözenekli tabaka sonuçları içinde konuk moleküllerin / hedef analitlerin Capture.

PSi optik biyosensör teknolojisinde büyük yenilik olsa da, bakteri tespiti 6,8,20,23-29 için PSi-tabanlı platformlarda sadece birkaç raporlar vardır. Buna ek olarak, bu proof-of-concept çalışmaların çoğu "dolaylı" bakteriler tespit göstermiştir. Bu durumda, hücre, genellikle önce lizis üzerinde çalışılan bakteriler 29 karakteristik hedeflenen protein / DNA fragmanları elde etmek için gereklidir. Bizim yaklaşım doğrudan hedef bakteri yakalamak içinPSi biyosensöründeki üzerine hücreler. Bu nedenle, hedef bakteri için özel olan monoklonal antikorlar, gözenekli yüzey üzerine immobilize edilir. , Antikor-antijen etkileşimleri yoluyla, bakteri hücrelerinin bağları, biyosensör yüzeyine yansıtma spektrumu 24-26 genliği (yoğunluk) içinde değişikliklere sebep olur.

Bu çalışmada, bir optik PSi bazlı biyosensör yapımı hakkında rapor ve Escherichia coli tespiti (E. coli) (model mikroorganizma olarak kullanılan) K12 bakteri. Izlenmesi için bir etiket içermeyen biyo-algılayıcı platformu olarak uygulanmasını göstermek optik sinyal nedeniyle Fabry-Perot ince film girişim (Şekil 1A) için PSi nano yansıyan ışıktır. Işık genlik / yoğunluğundaki değişiklikler hızlı algılama ve bakterilerin miktarının sağlayan, biyosensör yüzeyi üzerine hedef bakteri hücrelerinin spesifik hareketsizliğe bağlı olarak ilişkilidir.

Protokol

1.. Oksidize Gözenekli SiO 2 hazırlanması

  1. Sabit akımda 30 saniye boyunca, sulu HF ve mutlak etanol 3:1 (v / v) çözelti içinde Etch Si gofret (tek taraflı <100> yüzünde parlatılmış ve ağır katkılı, p-tipi, 0.0008 Ω · cm) 385 mA / cm 2 yoğunluğu. HF oldukça aşındırıcı sıvı ve aşırı dikkatle ele alınması gerektiğini unutmayın.
  2. Mutlak etanol ile elde edilen gözenekli Si (PSI) filmin yüzeyi birkaç kez duruladıktan sonra, bir kuru azot gazı altında kuru filmler.
  3. Havadaki 1 saat boyunca 800 ° C (rahatsız edecek, 1 saat boyunca fırında bırakmak, 800 ° C'ye kadar ısıtmak, oda sıcaklığında, fırın içindeki numuneyi bir tüp fırın içinde taze kazınmış PSi örnekleri okside ve fırın) Sadece oda sıcaklığında fırından örnekleri çıkarın.

2. PSiO 2 iskelelerinin Biofunctionalization

  1. Oksitlenmiş psi (PSi inkübeO 2) merkaptopropil 1 saat (toluen trimetoksisilan-3)% 95 (MPTS) çözeltisi (108 mM) örneği.
  2. , Tolüen, metanol ve aseton ile muamele edilmiş silan PSiO 2 örnek yıkayınız, kuru Bir kuru azot gazı altında.
  3. 100 mM PEO-iodoasetil biotin solüsyonu 1 ml, 30 dakika için silan-modifiye PSiO 2 örnek inkübe edin.
  4. 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile birkaç kez biyotin ile tedavi edilen PSiO 2 örnek durulayın.
  5. 100 ug / ml streptavidin (SA) çözeltisi 1 ml, 30 dakika boyunca biyotin ile modifiye edilmiş PSiO 2 örnek inkübe edin.
  6. 0.1 M PBS solüsyonu birkaç kez ile SA-tedavi PSiO 2 örnek durulayın.
  7. 100 ug / ml biyotinile E: 1 ml, 30 dakika için sonuçtaki SA-değiştirilmiş PSiO 2 örnek inkübe coli monoklonal antikor (immunoglobulin G, IgG) çözelti ya da 100 ug / ml biyotinile edilmiş tavşan-IgG'si ile (bir monoklonal antikor için bir model olarak).

3. Floresan Etiketleme ve Floresan Mikroskopi

  1. 15 ug / ml floresan (FITC) ile IgG-tadil edilmiş yüzeyler inkübe edin, 40 dakika için anti-tavşan IgG etiketlendi ve 15 ug / ml floresan (FITC) ile birlikte bir kontrol olarak anti-fare IgG etiketlendi.
  2. 0.1 M PBS çözeltisi ile birkaç kez değiştirilmiş örnekleri durulayın.
  3. Flöresanlı bir mikroskop altında örnekleri inceleyin.

4. Bakteriler Culture

  1. E. Yetiştirmek coli K12 Luria Bertani (LB) ortamı (: NaCI, maya ekstresi, 5 g 5 g, tripton ve 10 g deiyonize su, 1 L orta bileşimi) 5 ml, 10 ml bir tüp içinde bakteri. Bakteriler, gece boyunca 37 ° C'de çalkalanarak inkübe
  2. 600 nm'lik bir dalga boyunda optik yoğunluk (OD) okuyarak, bakteri konsantrasyonu izleyin. LB ortamında gece boyunca büyütmeden sonra, bakteriyel konsantrasyonunu belirlemek için bir spektrofotometre kullanılarak OD 600 okuyun. Hücrelerin sayısı korkunç olduğunuOD 600 ölçümleri (1 OD 600 = 10 8 hücre / ml) ctly orantılıdır.

5. Bakteriler Algılama

  1. IgG-modifiye PSiO 2 ve düzgün PSiO 2 (kontrol olarak), ısmarlama bir Plexiglas akış hücresi örnekleri yerleştirin. Örnek yansıtma tüm ölçümler sırasında aynı noktada ölçülür sağlamak için akış hücresi düzeltildi.
  2. E ile örnekleri inkübe Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca coli K12 süspansiyonu (10 4 hücre / ml). Daha sonra 30 dakika boyunca v tuzlu su çözeltisi / ağ% 0.85 ile yıkanarak hücre bakteri süspansiyonu çıkarın.
  3. Deney boyunca yansıtma veri değişiklikleri izler. Tüm optik ölçümler çevreleyen bir sulu gerçekleştirilebilir gerekir. Spectra bir CCD spektrometre kullanılarak toplanan ve daha önce 25,26 açıklandığı gibi hızlı Fourier, (FFT) uygulanarak analiz edilmelidir.
  4. Üzerindeki bakteri varlığını doğrulamakbiyoalgılayıcı yüzeyi hemen biyo-algılayıcı deneyden sonra dik bir ışık mikroskobu altında örneklerin gözlenmesiyle.

Sonuçlar

Protokol metin bölümünde açıklandığı gibi oksitlenmiş PSi (PSiO 2) filmler hazırlanır. Şekil 1B, termal oksidasyon sonra elde edilen PSi filmin yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu görüntüsüdür. PSiO 2 kat 30-80 nm aralığında bir çapı olan iyi tanımlanmış silindirik gözenekler ile karakterize edilir.

Monoklonal antikor (IgG) molekülleri, bir biotin-SA sistemi ile birlikte iyi kurulmuş bir silanizasyon tekn...

Tartışmalar

Bir PSiO 2 nano (bir Fabry-Perot ince film) dayalı bir etiket içermeyen optik immunosensor, fabrikasyon ve bakteri tespiti için bir biyosensör olarak potansiyel uygulanabilirliği doğrulanmıştır.

Değişiklikler ve sorun giderme

Bir immunosensor tasarımı en önemli sorunlardan biri de biyosensör duyarlılık 31,32 bir azalmaya yol açabilir katı substrat üzerine birikimi ve modelleme sırasında istenmeyen yapı değişikliklere ka...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Teşekkürler

Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (hibe No 1118-1108 ve hibe No 1146-1112) ve Minna Kroll Memorial Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. ES minnetle Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü'nün mali desteği kabul eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Si waferSiltronix Corp.Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)Merck101513
Ethanol absoluteMerck818760
PBS buffer solution (pH 7.4)prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/vprepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-iodoacetyl biotinSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptavidin (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidinJackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
Biotinylated-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
Biotinylated E. coli antibodyJackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

Referanslar

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
  9. Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
  18. Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 81analitik kimyasilikon malzemelermikrobiyolojioptik malzemelerg zenekli Sioptik biyosens rbakteri tespitietiket cretsiz biyosens rnanoyap lar nE coli Bakteri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır